二、海馬腦片的膜片鉗記錄
1、將刺激電極放置在含突觸前纖維腦片區域附近
在突觸傳遞的研究中,應該同時記錄突觸前和突觸后神經元的電信號,雖然,并不是所有突觸前神經元胞體的動作電位均可傳導至突觸 (Vincent,
1996)。由于在突觸前和突觸后兩個神經元上同時做膜片鉗記錄較困難,因此,需要用其它的方法來誘發突觸前動作電位的發放。用刺激電極可在單個或多個突觸前細胞或軸突誘發動作電位。另外,還可以用局部施加神經遞質的方法來誘導動作電位,如用短促的壓力、離子電泳或籠鎖谷氨酸光解等方法將谷氨酸加到突觸前胞體或軸突上,可以誘導出多個動作電位。
用電極刺激
在神經元培養皿中,可以用連接了電源(通常是膜片鉗放大器)的微電極直接刺激突觸前神經元。在這種情況下,通常需要用負壓吸引使突觸前的細胞貼緊刺激電極,防止刺激電流的逸出。通過膜片鉗放大器給脈沖刺激的優點是,它可以記錄到突觸前細胞被激活的胞外電信號(Role,
1987)。從培養的神經元和腦片上找到有突觸聯系的一對神經元是很困難的,但在神經元培養中有單個神經元的Autapic突觸就會方便許多。
可以用膜片鉗電極或尖端較細的一對鎢電極給突觸前軸突纖維施加電壓脈沖。用電極刺激可將Ag/AgCl電極置于孵育槽中與其構成一電流回路。刺激電流一定要與膜片鉗放大器記錄電路隔離開,以防止刺激電流漏入記錄電極中,而使刺激尾跡變得很大。為此,施加刺激需要一個未接地的隔離器。隔離器可以用外界脈沖刺激或計算機來控制。另外,還需要將刺激尾跡縮小到最小,以排除其對突觸信號起始段的干擾。為達到該目的,需將刺激電路的回路電極置于合適的位置或用膜片鉗放大器提高串聯電阻補償的效率。
刺激電極的位置
通常將刺激微電極或刺激電極置于突觸前軸突通過的部位。但有時突觸前軸突在制備腦片時即被去除。如果腦片制備時局部神經環路被破壞,實驗中就很難成功地記錄到突觸后電流。實際上,切腦片的角度是保存局部神經環路最重要的因素之一,合適的角度既可使突觸后神經元保存完好,也可保留部分較長的突觸前纖維用于電刺激。用胞外電極刺激激活的神經纖維較多,而且,每次刺激激活的纖維數目也會不同。如果實驗目的是將不同的傳導通路分開,那么,必須要證明兩個刺激電極激活的纖維各不相同。
2、全細胞記錄
用可視化膜片鉗尋找清楚、且表面光滑、折光性較好的突觸后神經元。在加了正壓后,將記錄電極移入腦片視野中,并接近事先選好的神經元,然后,調整電極與神經元的相對位置,利用負壓形成穩定的高阻封接。用短簇的脈沖負壓使細胞破膜,穩定2~3分鐘,觀察封接測試波形起始段與基線間的差值是否在100pA以內,封接電阻是否大于200M,如果是,且較穩定,再迅速補償串聯電阻和慢電容,舍棄串聯電阻大于30M的細胞,且在記錄過程中監測串聯電阻的變化,當變化大于20%時,中止記錄。如果細胞狀態不好,就馬上重新制備腦片,以提高實驗效率。
3、判斷突觸前纖維
在記錄電刺激的突觸反應時,可以驗證刺激電極是否放置在突觸前神經元或軸突上,在實驗中,如果記錄不到突觸反應,說明刺激電極位置不正確,這時可以稍微移動刺激電極的位置。如果還記錄不到,這可能還與組織片活性較差有關,可以更換組織片或改進切片角度加以解決。電刺激方波時程一般設定為0.1~0.2ms,恒流條件下刺激強度一般為0.1~3mA,恒壓條件下刺激強度為5~40V.