脾細胞和骨髓瘤細胞的融合

1、脾細胞和骨髓瘤細胞一般按2：1-5：1的密度混合，有的報道可以到10：1，不過總體來說我們常選3：1-5：1，記住，原則是脾細胞的數量比骨髓瘤的多。

2、融合前，一般用HAT培養基做飼養細胞鋪板，這是融合前的準備工作，因為飼養細胞分泌的某些細胞因子有助與融合的雜交瘤細胞生長，并且提供一定的細胞密度。通常是可以融合前一天做飼養細胞，老鼠選ICR或是BALB/C與ICR雜交的鼠，一只老鼠可以鋪2-3塊96孔板。

3、我們融合選用96孔細胞培養板。融合時將脾細胞與骨髓瘤混合后離心，然后用手掌稍稍搓離心管，將離心壓緊的細胞松散開，再加融合劑PEG，在 45秒內加完1毫升的PEG，之后靜置30-60秒，這個時間時給PEG作用使細胞膜融合的，此時將離心管握在手中，利用自己的體溫給細胞一個比較溫暖的環境。之后加30-40毫升DMEM終止（1640也行，只要用不完全培養基即可），一般前30-45秒速度慢一些，中間30秒可以一滴滴的加，最后 30-60秒就快速加。終止后靜置在37度水浴約10分鐘，然后離心，用HAT重懸，分裝96孔板即可。

4、融合后3-4天補加HAT培養基（2-3滴），融合后7-8天則開始給細胞換液，用HT培養基培養，根據你的細胞具體情況看，可以換1-2次液。一般細胞如果狀態好的話，9-11天就可以生長起來了，后面檢測細胞時HT培養細胞。