• <noscript id="0aaaa"></noscript>
  • <noscript id="0aaaa"><kbd id="0aaaa"></kbd></noscript>
    <table id="0aaaa"><option id="0aaaa"></option></table>
    發布時間:2020-08-10 15:14 原文鏈接: 膜片鉗操作實驗

    運用膜片鉗進行膜離子通道特性的研究,是一項艱辛、細致、繁雜的工作,要求較高的技術水平和實驗條件作保證,現在大致介紹一下膜片鉗實驗的過程,粗略地包括以下幾個方面。

     

    1. 標本制備 根據研究目的的不同,可采用不同的細胞組織,如心肌細胞、平滑肌細胞、腫瘤細胞等,現在幾乎可對各種細胞進行膜片鉗的研究。對所采用的細胞,必須滿足實驗要求,一般多采用酶解分離法,也可采用細胞培養法;另外,由于與分子生物學技術的結合,現在也運用分子克隆技術表達不同的離子通道,如利用非洲爪蟾卵母細胞表達外源性基因等。

     

    2. 電極制備 合格的膜片微電極是成功封接細胞膜的基本條件。要成功的封接細胞膜需要兩方面的因素保證,一是設法造成干凈的細胞膜表面,二是制成合格的電極。首先要選擇適當的玻璃毛細管,其材料可使用軟質玻璃(蘇打玻璃、電石玻璃)或硬質玻璃(硼硅玻璃、鋁硅玻璃、石英玻璃)。軟玻璃電極常用于作全細胞記錄,硬質玻璃因導電率低、噪聲小而常用于離子單通道記錄。膜片微電極是將玻璃毛細管用電極拉制儀拉制而成的,制作分三步進行:

     

    第一步是分兩次拉制,第一次拉長7~10mm,直徑小于200μm,在此基礎上進行第二次拉制,最終使尖端的直徑為1~2μm,兩步拉制的目的主要是使電極前端的錐度變大,狹窄部長度縮短,因此可降低電極的串聯電阻,也可減少全細胞記錄時的電極液透析時間。由于膜片微電極最忌沾染灰塵和臟物,更忌觸碰尖端附近部位,所以一般要求在使用前制作。

     

    第二步是在電極前端涂以硅酮樹脂(sylgard),其目的是為了降低電極與灌流液之間的電容,并形成一個親水界面。經此處理后,上述電容可由6~8pF減少到1pF以下。硅酮樹脂對形成Giga?鄄seals無影響,但可減少本底噪音,對單通道記錄很重要。在進行全細胞記錄時,不用硅酮樹脂也可以得到滿意的效果,通常微電極在涂抹硅酮樹脂后再進行拋光,但最好是在涂抹后一小時內拋光,否則很難改變電極尖端的形狀。

     

    第三步是拋光,將電極固定于顯微鏡工作臺上,在鏡下將尖端靠近加熱絲,當通電加熱時,可見電極尖端微微回縮,此時電極變得光滑,且尖端的雜質燒去,得到較干凈的表面。從而有利于和細胞膜緊密封接,并在封接后更易保持穩定。

     

    電極在實驗前要灌注電極液,由于電極尖端較細,因此在充灌前,電極內液要用0.2 μm的濾膜進行過濾。一般電極充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)兩步。灌尖時將電極尖端浸入內液中5s即可,由于毛細作用溶液會進入電極最尖端處,然后從電極后端用細小的聚丙烯注射管插至尖端附近將溶液充至1/4長度,用手指輕輕彈除尖端殘留的氣泡即可。灌注后的電極電阻一般為2~5MΩ,而全細胞記錄則最好在2~3MΩ。

     

    3. 膜片鉗實驗系統 根據不同的電生理實驗要求,可以組建不同的實驗系統,但有若干共同的基本部件,包括機械部分(防震工作臺、屏蔽罩、儀器設備架)、光學部分(顯微鏡、視頻監視器、單色光系統)、電子部件(膜片鉗放大器、刺激器、數據采集的設備、計算機系統)和微操縱器(圖1)。

     



    圖1
     

    在大多數膜片鉗實驗,要求所有實驗儀器及設備均具有良好的機械穩定性,以使微電極與細胞膜之間的相對運動盡可能小。防震工作臺放置倒置顯微鏡和與之固定連接的微操縱器,其他設備置于臺外。屏蔽罩由銅絲網制成,接地以防止周圍環境的雜散電場對膜片鉗放大器的探頭電路的干擾。儀器設備架要靠近工作臺,便于測量儀器與光學儀器配接。

     

    倒置顯微鏡是膜片鉗實驗系統的主要光學部件,它不僅具有較好的視覺效果,便于將玻璃電極與細胞的頂部接觸,而且是借助移動物鏡來實現聚焦,具有較好的機械穩定性。視頻監視器主要是用來監視實驗過程中的操作,特別是能將封接參數(如封接阻抗)與細胞的形態對應,以實現良好的封接。

     

    膜片鉗放大器是整個實驗系統中的核心,它可用來作單通道或全細胞記錄,其工作模式可以是電壓鉗,也可以是電流鉗。從原理來說,膜片鉗放大器的探頭電路即I-V變換器有兩種基本結構形式,即電阻反饋式和電容反饋式,前者是一種典型的結構,后者因用反饋電容取代了反饋電阻,降低了噪聲,所以特別適合超低噪聲的單通道記錄。由于供膜片鉗實驗的專用計算機硬件及相應的軟件程序的相繼出現,使得膜片鉗實驗操作簡便、效率提高。如與EPC-9型膜片鉗放大器(內含ITC-16數據采集/接口卡)配套使用的軟件PULSE/PULSEFIT,它既可產生刺激波形,控制數據采集,又可分析數據,同時具有用于膜電容監測的鎖相放大器,多種軟件功能集成于一體。

     

    4. 進行實驗,記錄和分析數據 準備工作就緒后即可進行實驗操作,數據記錄和分析。這里主要介紹高阻封接的形成(圖2)。
     

     

    對電極持續施加一個1mV、10~50 ms的階躍脈沖刺激,電極入水后電阻約4~6MΩ,此時在計算機屏幕顯示框中可看到測試脈沖產生的電流波形。開始時增益不宜設得太高,一般可在1~5mV/pA,以免放大器飽和。由于細胞外液與電極內液之間離子成分的差異造成了液結電位,故一般電極剛入水時測試波形基線并不在零線上,須首先將保持電壓設置為0mV,并調節“電極失調控制“使電極直流電流接近于零。用微操縱器使電極靠近細胞,當電極尖端與細胞膜接觸時封接電阻指示Rm會有所上升,將電極稍向下壓,Rm指示會進一步上升。通過細塑料管向電極內稍加負壓,細胞膜特性良好時,Rm一般會在1min內快速上升,直至形成GΩ級的高阻抗封接。一般當Rm達到100MΩ左右時,電極尖端施加輕微負電壓(-30~-10mV)有助于GΩ封接的形成。此時的現象是電流波形再次變得平坦,使電極超極化由-40到-90mV,有助于加速形成封接。為證實GΩ封接的形成,可以增加放大器的增益,從而可以觀察到除脈沖電壓的首尾兩端出現電容性脈沖尖端電流之外,電流波形仍呈平坦狀。

     

    在形成高阻抗封接后,記錄實驗結果之前,通常要根據實驗的要求進行參數補償,以期獲得符合實際的結果。需要注意的是,應恰當設置放大器的帶寬,例如10kHz,這樣在電流監測端將觀察不到超越此頻帶以外的無用信息。

     

    膜片鉗實驗難度大、技術要求高,要掌握有關技術和方法雖不是很困難的事,但要從一大批的實驗數據中,經過處理和分析,得出有意義、有價值的結果和結論,就顯得不那么容易,有許多需要注意和考慮的問題,包括減少噪音,避免電極前端的污染,提高封接成功率,具體實驗過程中還需要考慮如何選取記錄模式,為記錄特定離子電流如何選擇電極內、外液,如何選擇阻斷劑、激動劑,如何進行正確的數據采集等許多更為復雜的問題,還需在科研實踐中不斷地探索和解決。


  • <noscript id="0aaaa"></noscript>
  • <noscript id="0aaaa"><kbd id="0aaaa"></kbd></noscript>
    <table id="0aaaa"><option id="0aaaa"></option></table>
    色av