自動化拉曼光譜儀用于活細胞功能分類（一）

自動化拉曼光譜儀可以在單細胞層面進行功能分析，篩選對某種物質具有代謝活性的細胞用于后續分析，使得微生物生態的研究更加具有針對性和精確性。

2019年3月《Nature microbiology》期刊上，“自動化拉曼光譜儀用于活細胞功能分類”介紹了一個微流控光學平臺結合了微流體、光鑷和拉曼光譜技術，用于對穩定同位素標記的微生物細胞進行自動化分類，可以產生適合后續單細胞基因組學、微型宏基因組學以及純培養的活細胞。

An automated Raman-based platform for the sorting of live cells by functional properties

自動化拉曼光譜儀用于活細胞功能分類

本文描述了這個基于拉曼光譜的細胞分類技術的設計與優化，并舉例操作了四個模式細菌（包括2個腸道、1個土壤和1個海洋），展示了這項技術高的分類精度（98.3 ± 1.7%）、高的通量（200–500細胞每小時、3.3–8.3細胞每分鐘）以及培養的兼容性。使用這項技術用于細菌宏基因組分析研究小鼠結腸粘蛋白降解，結果顯示多種細菌（包括Muribaculaceae科的一些物種）參與其中，突出了這個生態位的復雜性以及拉曼光譜細胞分選用于鑒別所研究生態過程中關鍵物種的潛力。

環境以及宿主關聯的微生物組研究旨在了解復雜微生物群落的組成及功能。單細胞研究越來越重要，因為其可以提供系統發育和基因組多樣性、表型和微環境的異質性、微生物與宿主及病毒之間關聯的信息。通過在微生物群落中添加同位素標記的化合物，生理的原位分析也可以在單細胞水平實現。微生物細胞可以消耗這些化合物并整合到自己的生物量中，這時候可以通過自動射線照相技術、納米級二次離子質譜或顯微拉曼光譜技術來追蹤這些同位素。為了鑒定消耗這些化合物的細胞，這三種技術可以和熒光原位雜交結合在一起使用。

理論上，微生物學家可以對復雜微生物群落中的單個細胞進行功能分析，并直接獲取那些具有所研究功能的細胞的基因組。然而目前所有的單細胞基因組研究中，單個細胞是隨機抽取的或者根據某些遺傳特征使用PCR、熒光原位雜交抽取。最近有兩種方法可以基于代謝活性選擇微生物細胞進行全基因組擴增與測序，一是通過生物轉錄翻譯帶熒光標記的氨基酸序列標簽然后進行熒光激活細胞分選（FACS）；另一種是通過使用重水培養用穩定同位素氘進行標記，含氘的細胞可以使用拉曼光譜C-D指紋區域（2,040–2,300cm?1）進行鑒別。這種方法具有無破壞性、無需固定細胞、可以檢測樣品中所有代謝活性細胞的優點。使用這種方法，可以檢測當某種特殊化合物出現時具有活性的細胞，而這種化合物自身不需要標記。我們可以在毛細管中檢測拉曼光譜，并將氘標記的細胞通過光鑷進行分離。

本文介紹了一個全自動化的微流控平臺用于激活拉曼光譜的微生物細胞篩選，該平臺具有較高的通量，可以基于功能對細胞進行分選從而用于后續的培養、微宏基因組以及單細胞基因組分析。與以前的技術相比，該平臺不需要細胞含有能增強拉曼光譜檢測敏感度的化合物例如胡蘿卜素，從而可以適用于更大范圍的細菌、古菌以及所有的真核細胞。

RACS平臺使用微流控裝置來捕獲與移動微生物細胞，用于后續的拉曼光譜測量與細胞分選。此裝置依賴于三維微流道技術來控制樣品流在聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流體分選器中的位置。如圖1a所示，首先使用垂向鞘流將水平流動的樣品聚集到玻璃蓋玻片附近，從而保證光鑷較高的捕獲率并使用鞘液將樣品與PDMS隔開防止其對拉曼光譜的干擾（注sheath flow：微流控中的鞘流技術，在細胞計數中為了避免細胞從小孔邊緣處流過及湍流、渦流的影響，用毛細管對準小孔管，細胞混懸液從毛細管噴出。同時與四周流出的鞘液一起流過敏感區，保證細胞混懸液在中間形成單個排列的細胞流，四周被鞘液圍繞），實際效果如下面視頻1所示。而之所以使用玻璃而不是石英的蓋玻片，是為了防止在光譜檢測區的干擾（排列規則的晶體拉曼光譜更強）。在水平向樣品流的下游，設置另一處鞘流，使得細胞在默認情況下流向廢液流出口（實際效果如視頻2所示）。

RACS平臺的核心是一臺商用的共聚焦拉曼顯微鏡。在RACS平臺運行過程中，首先使用CCD相機1對兩束激光進行聚焦，之后分光鏡（注beam splitter：分光鏡，就是部分反射部分透射的介質，一般是半反射半透射的，通過鍍膜控制反射透射的比例）被移除，之后拉曼顯微鏡開始進行操作。細胞的捕獲、運輸和釋放過程通過CCD相機2來監測，拉曼顯微鏡的載物臺可以移動從而實現蓋玻片下方10μm處的聚焦點可以進行分選。

圖1. RACS平臺的設計與工作原理（a. 樣品流中的細胞水平進入微流控裝置，并通過垂向和水平向的兩個鞘流進行控制，使其單個排列流過，默認情況下流向廢液出口，綠色圓圈中被光鑷捕捉的細胞移動到遠離樣品的鞘流區進行拉曼光譜測量，檢測到的標記細胞被釋放到收集出口，而未被標記的細胞則帶回樣品流釋放到廢液出口 b. 微生物細胞被限制在光鑷中 c. 歸一化的細胞中拉曼光譜信號分布 d. 整個平臺配置流程圖，拉曼測量光源和光鑷光源由激光器產生并通過60倍物鏡被聚焦到微流控裝置的同一位置，CCD相機1用來激光校對，之后可移動的分光鏡去除，在檢測中攜帶散射光的混合光被導向波譜分析儀用于拉曼光譜分析，過程中使用過濾器過濾掉激光光源的光，微流控裝置下方有環形光源，以幫助CCD相機2實時監控細胞分選過程）

對于單個細胞，如果檢測到可靠的拉曼光譜標準證明其含有氘，那么便將其釋放到收集出口而非廢液出口。本文使用三個革蘭氏陰性（兩個腸道的一個海洋環境）與一個革蘭氏陽性（土壤環境）細菌物種（Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Marinobacteradhaerens和Bacillus subtilis）為例，通過波長1620-1670 cm?1之間的拉曼光譜信號的增強來判斷細胞出現在光鑷之中（如圖3a所示），因為這一區域不受PDMS和玻璃的影響，因此細胞指數可以通過有細胞存在時的信號與空白對照的比值來計算：

使用CCD相機2進行觀測發現光鑷中出現細胞總會有PC>1.0（無論是否氘標記），且含有氘標記的PC值稍低于未標記細胞，四個物種的PC值對比如圖3c所示，根據評估選用PC>1.7（PC>1.2對于M. adhaerens）作為光鑷捕獲細胞的判斷依據。用戶可以設置CCD相機2的閾值來自定義光鑷捕獲標準。

如圖2a所示，一旦成功捕獲細胞，RACS平臺移動包含細胞的光鑷到評估區域，然后根據拉曼光譜C-D指紋區域（2040–2300 cm?1）判斷細胞是否含有氘標記。標記指數可以通過波長2040–2300 cm?1區域與1850–1900 cm?1區域的信號比值來計算：

選擇波長1850–1900 cm?1區域作為參考是因為其對于設備材料PDMS和玻璃不敏感（而且經過前面判斷已經確定包含細胞，不用再考慮空白液體的光譜）。不同物種標記的和未標記的細胞PL值如圖3d所示，所有未標記的細胞PL<6.69，因此可將PL>6.69作為可靠的氘標記判斷標準。

如圖3b所示，經過反復測量顯示細胞拉曼光譜測量時間越長，PL與PC值越穩定，PC值需要2秒時間測量足以穩定，而PL值需要5秒時間。根據這個參數，全自動化的RACS平臺分選細胞的速度達到200細胞每小時（也即3.3細胞每分鐘）。

圖2. 微流控裝置內的細胞分選操作（a. 微流控分選的監控圖，因為裝置反光，光鑷周圍可以看到環形照明燈，CL為捕獲區域，EL為評估區域，光鑷在這兩個區域之間往復移動 b-e. 氘標記細胞的分選過程，最終在評估區域釋放被帶入收集出口 f-i. 未標記細胞被帶回捕獲區域釋放，被帶入廢液出口）