花粉管中線粒體移動的活體動態觀測

實驗概要

在本實驗中，應用Mitotracker Red染料對花粉管中線粒體進行活體標記，并結合激光共聚焦顯微鏡和隱失波顯微鏡技術，研究了花粉管細胞骨架及其相應的馬達蛋白等對于線粒體分布、線粒體的移動和停泊的調節作用。

主要試劑

MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) 50 μg藥品加入94 μL DMSO溶解，配成1 nmol/μL的母液，-20℃避光保存。

主要設備

激光共聚焦顯微鏡ZEISS LSM 510 META (Germany)

倒置顯微鏡 (IX81; Olympus)

高孔徑物鏡 (Apo 1003 OHR，NA 1.65，Olympus)

實驗材料

青杄花粉。稱取10 mg青杄花粉懸浮培養于液體培養基中，置搖床(125 rpm)中，24℃恒溫培養。培養基含有12% 蔗糖   0.01% H₃BO₃   0.03% CaCl₂，pH 6.4 (PBS)。

實驗步驟

1. 抑制劑處理

所有的化學試劑來自于Sigma  (St Louis, MO, USA)，除非有特別說明。1mM latrunculin B (LATB)，1mM taxol和100 μM  jasplakinolide (Molecular probes, Eugene, OR, USA)  儲存液用DMSO配制，-20°C下保存。2,3-butanedione 2-monoxime (BDM) 溶液現配現用，用雙蒸水配制成 500  mM 母液。20mM  oryzalin母液用100% ethanol 配制，-20°C保存。抑制劑處理時直接將母液加入培養18  h的青杄花粉管中，孵育5-10 min。各種藥物處理的最終濃度為LATB 10 nM，Jas 100 nM，oryzalin 100  μM，taxol 5 μM，BDM 50 mM。

2. MitoTracker染色

收集各種抑制劑處理的青杄花粉管，加入MitoTracker Red CMXRos，使其終濃度為250 nM, 室溫孵育5 min，顯微鏡觀測。

3. 線粒體的顯微觀察

激光共聚焦顯微鏡的觀察采用ZEISS LSM 510 META (Germany)系統，63ⅹ水鏡，激發波長為514 nm，采集濾光片為560--640 nm.

隱失波熒光顯微鏡是在倒置顯微鏡的基礎上構建的。多通道氬離子激光發射器發出的光  (458，488，515 nm，30 mW) 通過單模塊光纖維和三組照明鏡頭聚焦在高孔徑物鏡 (Apo 1003 OHR，NA  1.65，Olympus)  的背面，從而產生隱失波，允許樣品表層的熒光被激發。通過調節入射光的角度可以收集到不同樣品深度的熒光。MitoTracker 的激發波長為514  nm。熒光通過100倍油鏡，530-600 nm濾光片，由電耦合CCD (Micromax, MMX-512-BFT，Princeton  Instruments)以200 ms/幀的速度收集time-lapse圖像序列。

4. 花粉管微絲的標記

    將不同抑制劑處理的花粉管在新鮮配制的4%多聚甲醛 (50 mM Pipes buffer, pH 6.9)  固定1h，固定時同時抽氣幾分鐘。用50 mM Pipes buffer洗滌三次，花粉在含有1%果膠酶和1%纖維素酶的50 mM Pipes  buffer37℃下孵育15 min。用50mM Pipes buffer洗滌三次后，樣品再用1%Triton -100室溫孵育40min。50  mM Pipes buffer洗滌三次后，樣品用0.2 nM phalloidin-TRITC溶于PBS (pH 6.9)  buffer暗處理1 h。滴入50%甘油 (含抗熒光淬滅劑)，用指甲油封片。在激光共聚焦顯微鏡 (ZEISS，META510)  下，Ar/Kr激光，激光波長515 nm。每個樣品取20－30個不同光學切片掃描，最后將所有光切面的圖象疊加成像。