實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
|---|---|
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 原位雜交的基本操作方法（圖
14 .2 ) 演化自 Southern 雜交：標底是玻片上的染色體和細胞核，探針是帶標記的待測 DNA 序列 [ 本書中即是轉基因和對照，圖
14.3(a) ]。對探針和染色體分別或同時進行變性處理，以便產生雜交分子（圖 14.2)。多數實驗方案采取雜交過夜的方式，這對于低拷貝
FISH 非常重要。而對檢測重復 DNA 序列，雜交時間有幾小時就足夠了。正如 Southern
雜交一樣，需要經過數次的洗滌，目的是去除未結合的探針并鑒定雜交的緊密性，也就是鑒定探針和目的 DNA 序列的相似度，而這是在一個雙鏈 DNA
螺旋中保持穩定雜交的必要條件。為了準備染色體，除了雜交溫度、鈉離子濃度和洗滌液等條件外，一種雙螺旋去穩定劑如甲酰胺也可以調控雜交緊密度。在直接
FISH 技術中，染色體可以馬上復染，常用 DAPI 復染；在使用熒光素和地髙辛標記的非直接性 FISH 中，需要使用免疫細胞化學的方法做檢測。 染色體熒光染色 [ 圖14.1 (a ) ] ，按照染色體固定和制備的操作，檢測轉基因的株系及個體的倍性水平（見 3.1 節和 3.2 節），然后進行復染、封片和分析等步驟（見 3.7 節和 3.8 節）。 1. 材料固定 制備含有大量干凈而鋪展的分裂中期染色體，是保證 FISH 和染色體染色成功的重要因素。用于固定和染色體制備的植物材料必須是健康、無病害并生長旺盛的。它可以是任何分生組織，但在轉基因植株生長過程中，用什么材料做檢測，則取決定于試驗的時間，可以取幼苗的根尖、盆邊緣老株上新長的根尖，或者水培植株的根尖。對某些物種來說，也可以選用嫩枝、葉片或新芽的分生組織細胞。 在多數情況下，獲得最大數量的分裂中期的染色體對試驗成功是很重要的。為了獲得更多的處于分裂中期的細胞，常常需要對材料進行預處理，使染色體發生濃縮，并破壞紡錘體微管，以獲得充分分散的染色體。紡錘體微管抑制劑，如秋水仙素 （ 廣泛用于染色體計數）可以形成高度濃縮的染色體，另一些染色體濃縮劑，如冰水或者 8- 羥基喹啉，能產生更為伸展的染色體，以更適合于 FISH 分析。 ( 1 ) 所有步驟均使用干凈的鑷子在干凈的容器中進行。在收集和預處理階段（步驟 2~4 ) ，避免將材料接觸固定劑和化學藥品（見注 11)。 ( 2 ) 選擇合適的植株材料以獲得分裂期細胞。確認材料生長于適宜條件下。  ( 3 ) 選擇細胞分裂期阻滯劑加入試管中。 ( 4 ) 將根 （1~2 cm 長）或者芽轉移至 3~5 ml 的分裂期阻滯劑中（見注 12) ，試劑用量是材料的 5 倍，然后將蓋子擰緊。 ( 5 ) 培育。 ( a ) 冰水： 24 h ( b ) 8-烴基喹啉：生長所需溫度下放置 30~45 min , 然后 4℃、30~45 min。 ( c ) 秋水仙素：室溫 2~4 h 或者 4°C 、12~16 h 。 ( 6 ) 將材料迅速吸干，放入新鮮固定劑中。為保迅速滲透，確保固定劑沒有水分污染。除管子上用（油墨）氈筆做標記外，用鉛筆在便簽或小紙片上做好記號，然后將紙片一并放入固定劑中。 ( 7 ) 室溫放置 1 h，然后保存于 4°C 或者 -20℃（見注 13 ) 。 3.2 染色體制備 無論是熒光染色還是 FISH，分裂期和分裂間期的染色體制備均于載物片上進行。 建議使用蛋白水解酶對材料進行預處理，以去除細胞壁和細胞質，再將樣品置于載玻片上，滴上乙酸，然后蓋上玻片壓片。所有操作均于室溫下進行，除非是特殊說明。在洗滌和材料準備時使用小培養皿，方法見 2. 2 節。 ( 1 ) 用酶緩沖液洗滌植物材料上的固定劑兩次，每次 10 min 。 ( 2 ) 轉移植物材料到 1~2 ml 酶解液中，依據材料的不同在 37℃ 溫育 30 min 到 2 h ( 見注 2 ) 。 ( 3 ) 將植物材料從酶解液轉移至酶緩沖液。 ( 4 ) 將 2~3 份材料移至 0.5 ml 45% 的乙酸中，放置幾分鐘。如果材料太軟，此步驟可以省略。 ( 5 ) 將載玻片浸泡到 96% 的乙醇中再用無毛布擦干。載玻片上滴一滴 60% 乙酸。 然后將一小塊根尖或其他的材料放入乙酸中。可根據需要更換乙酸。 ( 6 ) 在解剖鏡下，撕開組織或用玻棒輕敲組織并去掉顆粒物。處于分裂期的細胞更易浮起。 ( 7 ) 用手紙擦蓋玻片后放到玻片上，相差顯微鏡觀察。為獲得最適片子，用手( 拇指）壓片，用力或輕或重，根據需要。也可敲打蓋玻片（譯注： 建議用皮頭鉛筆的橡皮頭敲）。 ( 8 ) 顯微鏡下觀察細胞密度和分裂中期指數，將比較好的樣品放置到金屬板上置于干冰中 5~10 min ( 不要過長時間）。用刺須刀刀尖輕輕挑開蓋玻片，然后風干。 ( 9 ) 相差顯微鏡下瀏覽未封片的玻片。尋找充分分散、不成堆聚集的細胞核，玻片應沒有表層膜和雜質。分裂中期染色體應該充分分散，沒有細胞質和雜質殘渣等。對每張玻片進行記錄以優化下次制片過程。小染色體可以通過 DAPI 染色來檢測（見 3.7 節)。 ( 10 ) 在玻片上劃上線以標記樣品所在玻片上的位置，因為在其后的步驟中，樣品位置在潮濕的玻片上是看不見的。 ( 11 ) 玻片于 4℃ 干燥保存數天或者于 -20℃ 保存數月（見注 13)。 3.3 探針標記 因為基于隨機引物法或缺口前移原理的相關操作說明在商用試劑盒已有提供，本章不再講述標記 DNA 的實驗操作方案。直接 PCR 標記法也是常用的方法，這種方法是在擴增克隆的特定片段，或擴增總基因組 DNA 的特定片段時，結合引入帶標記的分子。 為保證 FISH 的成功，必須在探針中引入比例合適的帶標記分子，以便于檢測。為使聚合酶作用更有效，帶標記的核苷酸（dUTP 或 dCTP ) 與非標記 TTP 或 CTP 按 1 :2 混合。試劑生產商常常提出標記核苷酸的推薦濃度和稀釋度，以獲得最佳整合效率。這是一個標準實驗的起點要求量，不過一些非常昂貴的標記核苷酸，尤其是剛打開的還未經多次凍融的試劑，其用量可以減少至推薦用量的 50%~70%。另一個重要因子是標記后探針的長度。探針不能太長，一般是 200~600 bp，以免不能滲透進染色體的 DNA 中。隨機引物法和缺口前移法產生的探針長度恰好適宜于 FISH，不過，有時可能需要對缺口前移酶體系中的 DNA 酶組分加以調整。用 PCR 法標記較大的插入克隆，可能不會得到好的探針。 另一個影響標記成功與否的因素是模板 DNA 的純度，以及用于加標記的 DNA 模板序列的長度。使用克隆片段時，要確保小量制備的 DNA 是純凈的、未受細菌污染，這樣插入片段才能被干凈、完整地酶切。對較小的插入片段（100 bp 到 2 kb ) ，推薦使用 M13 測序通用引物進行 PCR 擴增，這樣能獲得非常純凈的模板 DNA。在用隨機引物法或切口前移法進行標記前，最好將 PCR 產物經電泳后割膠回收目的條帶，以純化模板 DNA。對較長產物，小量提取的 DNA 可以在質粒線性化或酶切目的片段后直接標記。 不過，我們發現大的 DNA 分子常常不會是很好的模板，可能的原因是，如果聚合酶不在 DNA 模板分子的末端停止，酶就無效了。因此，將大 DNA 分子通過超聲、加熱或者酶切的方法處理后，再進行標記效果會更好（ 見 [ 4 ] 、[ 1 9 ] ) 。 檢測轉基因片段時，推薦使用生物素標記法 [ 圖14.3 (a ) ] ，因為生物素是最小的半抗原，通常最易整合，市場上也有銷售專用的生物素試劑盒。其次，許多不同的親和素、鏈霉親和素或者抗生物素抗體，能與熒光染料緊密而穩定的連接，這些都可以從市場上購得（ 如 Alexa dyes和 Molecular Probes公司）。作為第二對照或者指示探針，可用地高辛或直接熒光染料標記，建議使用 5S rDNA，因為它廣泛存在，并且在許多物種中都有主熒光和次熒光位點 [ 圖 14.3 ( a ) ] ，能提供最好的 FISH 實驗對照。45S rDNA 也可以使用，但是常常有強熒光位點出現，其熒光信號強過轉基因的雜交信號。另一個非常好用的是重復 DNA 序列，它可以幫助鑒定染色體。 3.4 玻片材料預處理 開始原位雜交前，應將玻片材料進行預處理以增強探針向目標位點的滲透，如用胃蛋白酶或蛋白水解酶處理表面蛋白，并減少非特異性探針與檢測試劑的結合，如 RNA 酶和胃蛋白酶/蛋白水解酶處理。之后將樣品用多聚甲醛和乙醇再固定，使樣品經多次洗滌后仍穩定存在。 ( 1 ) 所有步驟均于室溫下染色缸里進行，除非其他說明。 ( 2 ) 在每個玻片劃標記處加入 200 μl RNA 酶，蓋上塑料蓋玻片，在保濕盒中溫育 1 h。 ( 3 ) 去掉蓋玻片，將載玻片在 2x SSC 中洗滌兩次，每次 5 min。 ( 4 ) 玻片放入 10 mmol/L HCl 搖晃 2 min 左右，每張玻片迅速加入 200 μl 胃蛋白酶液，蓋上塑料蓋玻片，37℃ 溫育 10 min ( 見注6) 。 ( 5 ) 在蒸餾水中洗脫蓋玻片，然后用 2X SSC 洗玻片兩次，每次 5 min。 ( 6 ) 將玻片放入通風櫥中盛有多聚甲醛固定劑的染色缸中放置 10 min。 ( 7 ) 2X SSC 洗玻片兩次，每次 5 min。 ( 8 ) 濃度梯度乙醇逐級脫水（70% 、90% 和 96% 各 2 min ) , 風干。 3.5 雜交混合變性和雜交 ( 1 ) 離心管中準備雜交液，見表14. 1，充分混合。  ( 2 ) 在離心管中加入 34 μl 雜交液、2 μl 轉基因探針、1 μl 指示探針或對照探針，蒸餾水補齊至 40 μl，作為探針混合液。 ( 3 ) 探針變性，放入 70°C 水浴鍋 10 min , 然后置冰上 5 min。 ( 4 ) 將探針混合液滴到玻片上染色體所在位置，用塑料蓋玻片蓋好，注意去除所有氣泡，如有氣泡，需要揭開蓋玻片重新蓋上。 ( 5 ) 將玻片放到加熱塊上，升溫至變性所需溫度，一般是 75°C、8 min。根據不同物種、不同制備方法和材料儲存時間的不同，變性溫度在 70~95℃ 之間，時長 6~12 min ( 見注 14)。 ( 6 ) 降溫至 37℃ 放置 10~20 min , 將溫度保持在 37℃ 準備雜交。 ( 7 ) 如果加熱板可以保濕，可將玻片保留在加熱板上，如果不行，將玻片轉移到烘箱的保濕盒或者水浴鍋中用于雜交。注意不要讓樣品干掉，也不要讓冷凝水積累到樣品上。過夜（16 h ) 。 3.6 嚴謹性洗滌和雜交位點檢測 ( 1 ) 配制洗滌液和檢測緩沖液，見 2 . 6 節。 ( 2 ) 從雜交中取出玻片，檢查樣品是否蒸干或者被冷凝水打濕。 ( 3 ) 在 42℃、2X SSC 中將蓋玻片浮去，注意玻片間不要刮擦。 ( 4 ) 玻片于 42℃、2X SSC 中洗滌 2 min。 ( 5 ) 玻片于 42℃ 嚴謹性洗滌液中溫育兩次，每次 5 min , 準確測定并記錄洗滌液的溫度。使用 0.1% x SSC 高嚴謹度洗滌或者 2X SSC 低嚴謹度洗滌（見注8) 。 ( 6 ) 玻片于 42°C 的 2x SSC 中洗滌三次。 ( 7 ) 從水浴鍋中拿出玻片，自然冷卻 10~15 min。 ( 8 ) 玻片轉移至檢測緩沖液放置至少 5 min。 ( 9 ) 在每個玻片的記號處加入 200 μl 的 BSA , 蓋上塑料蓋玻片放置 5~30 min。 ( 10 ) 根據探針標記準備檢測液（見 2. 6節），去掉 BSA , 吸取 50 μl 檢測液到玻片上 ，蓋上塑料蓋玻片，37℃ 保溫箱溫育 60 min ( 見注9) 。 ( 11 ) 去掉蓋玻片，檢測緩沖液洗滌三次，每次 5 min。 3.7 復染及封片 大多數樣品需要進行 DNA 復染來觀察染色體。復染染料顏色必須與探針顏色不同，其信號也不能太亮使雜交信號模糊。因此，建議先染色再封片。一些實驗操作將復染和封片合并為一步，這樣做省了一個步驟，但是可能導致染色過度和背景值偏高。第一個熒光 FISH 實驗使用碘化丙啶染色，當用藍光或者綠光作為激發光時，染色體呈紅色。 雙靶標 FISH 實驗中，當用紅色和綠色標記熒光探針時，使用 DAPI 在紫外激發下呈藍光比較合適（圖 14.3)，因為它常常能同時顯示出異染色質帶型。在制備染色體過程中， DAPI 也是一種檢測染色體的質量和數目的很好染料，當染色體很小時它特別有用 [ 圖 14.1 (a ) ] 。 ( 1 ) 向載玻片上滴入 50~100 μI 的染色液，用塑料蓋玻片蓋好，然后于室溫、黑暗下放置 10 min (見注5) 。 ( 2 ) 移除蓋玻片，用檢測緩沖液短暫洗滌（ 見 4 . 2 . 6節）。 ( 3 ) 吸干緩沖液，向蓋玻片上滴入一滴抗熒光淬滅封片液，然后蓋上玻璃蓋玻片。配合濾紙片用手擠壓玻片以去除多余封片液（ 見注15)。 ( 4 ) 玻片觀察。淬滅劑可能需要幾個小時才能滲透至樣品中，因此可放置過夜后再進行觀察和拍照。 3.8 觀察和拍照 使用落射熒光顯微鏡觀察探針雜交點和染色體染色。本章不是對顯微鏡的使用進行說明，只是對一些常見問題和解決辦法提出如下建議。 ( 1 ) 即使使用很好的熒光抗衰劑封片，熒光染料和原位雜交信號也可能非常微弱并會迅速衰減，因此顯微鏡應置于一個全黑暗房間的固定臺面上，并且擺放要便于操作。確保系統合理放置，調整光源居中。 ( 2 ) 確保儀器和浸油以及 UV 為熒光專用。浸油應室溫黑暗放置。運輸車內陽光的熱量、混合油、浸油吸水等都會促使浸油自發熒光或者不透 UV。 ( 3 ) —般情況下，最好使用針對單一熒光的特定濾波片。多通道濾波片也可以買到，但由于不同熒光的光強不一樣導致這種玻片不太好用，并且不同熒光間的雜交激發常使結果很難分析。確保濾波片沒有隨著使用時間的增加而發生特性改變。 ( 4 ) 使用膠片或者數碼相機拍照。兩者都能獲得滿足發表標準的圖像分辨率。但是，必須注意的是，不管多貴的數碼系統都無法補償顯微鏡直接觀察的優勢。當使用膠片時，彩印膠片比幻燈片更好，因為它有更好的曝光范圍，并且價格和打印都更便宜。 ( 5 ) 玻片應一直放在抗衰減劑中，這樣能極大地阻止熒光信號的衰減。 ( 6 ) 記錄熒光信號前要特別小心，不要讓染色體信號尤其是微弱的 FISH 雜交信號衰減。低倍鏡下觀察一般不會衰減信號。但到 63x 和 100x 時衰減很迅速。有必要先安裝好照相系統，焦平面一旦聚焦就可迅速按下曝光鍵。先將 FISH 信號拍照記錄好，在找到滿意的 FISH 雜交信號前，不要用 DAPI 觀察染色體熒光。 ( 7 ) 當觀察一個肉眼幾乎看不見的弱熒光信號時，聚焦圖像會很困難。可以在紅光和綠光焦平面之間輪換著觀察。DAPI 不便這樣操作。 ( 8 ) 不論使用數碼相機還是普通膠片，使用圖像處理軟件（ 如 Adobe Photoshop、Corel Draw 或者其他類似軟件包）分析，疊加和組合各種圖片是最方便的。但是，必須注意圖片不可過度處理。責任人必須清楚地意識到對實驗室成員的圖像處理是要負責任的！ 3.9 轉基因的 FISH 分析 實驗中最困難的部分可能是判斷所觀察或記錄的信號是否真實可信，尤其是低拷貝轉基因的信號。 ( 1 ) 檢查有絲分裂中期是否完整，染色體形態是否保存完好。染色體可以稍顯臃腫，但不能太發散。染色體應該沒有破損，沒有洞隙或扭曲。 ( 2 ) 確保對照探針有預期結果。 ( 3 ) 注意觀察背景信號和非特異性交叉雜交信號，它們可能模糊掉真正的 FISH 信號 [ 圖 I 4.3 (b ) 和 圖 14.3 (c ) ] 。任何焦平面外產生清晰邊緣的信號都可以去除 [ 見圖14.3 (a ) ] 。星點狀強信號 [ 圖 14.3 ( d ) ] 常常意味著探針或檢測劑已經變質。 ( 4 ) 統計染色體上的轉基因 FISH 信號。分析若干有絲分裂中期細胞，可能的話，鑒定出染色體和 FISH 信號的位置。在一個正常的二倍體細胞中，一個二倍體位點應該在同源基因所在的兩條染色質的相同位點上產生熒光信號（ 見注16)。當目的條帶小于 50 kb 時，由于染色體的螺旋和擠壓，不太可能在同一個分裂中期細胞中觀察到所有位點的信號，所以在任意某個分裂中期細胞中，不要指望看到所有的信號點。不過觀察 5~10 個或更多分裂中期細胞后，應該能確定哪個是真實信號，哪個是背景信號。當觀察到熒光強度高和可靠性好的信號時，表明幾個轉基因以串聯的方式整合到基因組中了[ [18]、[ 19 ] , 見圖 14 .3 (a ) ] 。 ( 5 ) 最重要的一點是要比較同一個探針或者同一批實驗所得到的玻片，以此排除實驗失敗、實驗污染或探針標記無效、抗體稀釋度不合適或者其他試劑使用不當等因素。 |
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