熒光原位雜交技術檢測植物基因組中整合的轉基因片段實驗
實驗材料 核苷酸
試劑、試劑盒 冰水8-羥基喹啉秋水仙素固定劑酶解緩沖液
儀器、耗材 載玻片玻璃蓋玻片解剖針及鑷子
實驗步驟
原位雜交的基本操作方法（圖 14 .2 ) 演化自 Southern 雜交：標底是玻片上的染色體和細胞核，探針是帶標記的待測 DNA 序列 [ 本書中即是轉基因和對照，圖 14.3(a) ]。對探針和染色體分別或同時進行變性處理，以便產生雜交分子（圖 14.2)。多數實驗方案采取雜交過夜的方式，這對于低拷貝 FISH 非常重要。而對檢測重復 DNA 序列，雜交時間有幾小時就足夠了。正如 Southern 雜交一樣，需要經過數次的洗滌，目的是去除未結合的探針并鑒定雜交的緊密性，也就是鑒定探針和目的 DNA 序列的相似度，而這是在一個雙鏈 DNA 螺旋中保持穩定雜交的必要條件。為了準備染色體，除了雜交溫度、鈉離子濃度和洗滌液等條件外，一種雙螺旋去穩定劑如甲酰胺也可以調控雜交緊密度。在直接 FISH 技術中，染色體可以馬上復染，常用 DAPI 復染；在使用熒光素和地髙辛標記的非直接性 FISH 中，需要使用免疫細胞化學的方法做檢測。
染色體熒光染色 [ 圖14.1 (a ) ] ，按照染色體固定和制備的操作，檢測轉基因的株系及個體的倍性水平（見 3.1 節和 3.2 節），然后進行復染、封片和分析等步驟（見 3.7 節和 3.8 節）。
1. 材料固定
制備含有大量干凈而鋪展的分裂中期染色體，是保證 FISH 和染色體染色成功的重要因素。用于固定和染色體制備的植物材料必須是健康、無病害并生長旺盛的。它可以是任何分生組織，但在轉基因植株生長過程中，用什么材料做檢測，則取決定于試驗的時間，可以取幼苗的根尖、盆邊緣老株上新長的根尖，或者水培植株的根尖。對某些物種來說，也可以選用嫩枝、葉片或新芽的分生組織細胞。
在多數情況下，獲得最大數量的分裂中期的染色體對試驗成功是很重要的。為了獲得更多的處于分裂中期的細胞，常常需要對材料進行預處理，使染色體發生濃縮，并破壞紡錘體微管，以獲得充分分散的染色體。紡錘體微管抑制劑，如秋水仙素 （ 廣泛用于染色體計數）可以形成高度濃縮的染色體，另一些染色體濃縮劑，如冰水或者 8- 羥基喹啉，能產生更為伸展的染色體，以更適合于 FISH 分析。
( 1 ) 所有步驟均使用干凈的鑷子在干凈的容器中進行。在收集和預處理階段（步驟 2~4 ) ，避免將材料接觸固定劑和化學藥品（見注 11)。
( 2 ) 選擇合適的植株材料以獲得分裂期細胞。確認材料生長于適宜條件下。
( 3 ) 選擇細胞分裂期阻滯劑加入試管中。
( 4 ) 將根 （1~2 cm 長）或者芽轉移至 3~5 ml 的分裂期阻滯劑中（見注 12) ，試劑用量是材料的 5 倍，然后將蓋子擰緊。
( 5 ) 培育。
( a ) 冰水： 24 h
( b ) 8-烴基喹啉：生長所需溫度下放置 30~45 min , 然后 4℃、30~45 min。
( c ) 秋水仙素：室溫 2~4 h 或者 4°C 、12~16 h 。
( 6 ) 將材料迅速吸干，放入新鮮固定劑中。為保迅速滲透，確保固定劑沒有水分污染。除管子上用（油墨）氈筆做標記外，用鉛筆在便簽或小紙片上做好記號，然后將紙片一并放入固定劑中。
( 7 ) 室溫放置 1 h，然后保存于 4°C 或者 -20℃（見注 13 ) 。