熒光定量PCR屬于精密性試驗，需要專業人員操作，在操作過程中需要注意各方面細節實驗以保證熒光定量PCR實驗步驟的可靠可重復性。
1 熒光定量PCR操作注意點：
實驗室注意分區：試劑準備間，樣本處理間，PCR室，電泳間要有明確區分，各房間實驗室的實驗服不得混用；
試劑準備間及樣本處理間不處理實驗相關的高濃度的核酸模板（如高濃度的標準品，PCR產物，miRNA的minics等）；
減少頻繁多次的走動，尤其去過電泳間之后當天不可進入其他房間；
使用生物安全柜加樣，不同位置的移液器不可混用，不要隨意更換其位置；
在檢測體系中添加UNG酶系統用于避免PCR產物的污染。
2 試劑質量控制：
對每批次配制或購買的試劑進行質檢，保證試劑的性能穩定可控，均一。
3 試劑使用注意事項：
試劑使用前必須混勻。
4 移液器操作注意事項：
使用結束后調整至最大量程，取樣時槍頭深入頁面的深度盡量一直保持在1-2mm之間，避免外壁沾過多試劑隨加樣進入導致重復性不好。
5 反應液配制及注意事項：
加樣使用合適量程的移液器；對于較小體積的移液，取液時候，不可深入液體太多以免試劑沾到吸頭外壁至移液量不準確，深入1-2mm即可（尤其是粘稠試劑，如酶，甘油等）；
小體積試劑加樣務必：取液后眼觀是否取到液體，加樣務必浸入混合液一下吹吸數次，棄吸頭前眼觀確定吸頭中無殘留。
6 反應液分裝及注意事項：
反應液分裝前必須混勻（比如渦旋震蕩或移液器吹吸混勻）再分裝；反應液第一個孔分裝必須潤一下槍頭，96孔之間加樣間隔時間盡量保持一致，96孔的點樣位置盡量保持在96孔的相同位置，復孔之間盡量相鄰點樣，點樣按照一定的順序，吸取時槍頭深入頁面的深度盡量一直保持在1-2mm之間；
加樣使用移液器鑲緊移液器吸頭，每次按至第一檔即可，不可按至第二檔，避免氣泡產生和加樣不準確（注：這個并不是唯一使加樣準確的方式，只要保持所有孔的加樣方式相同，可減少加樣誤差；）加樣盡量勻速，不要加樣到孔外面，以免對后面封膜造成影響；
點樣結束后，觀察是否有漏加樣本，或加錯樣本。