熒光素酶檢測值達到多少算有活性

熒光素酶（英文名稱：Luciferase）是自然界中能夠產生生物熒光的酶的統稱,其中最有代表性的是一種學名為Photinus pyralis的螢火蟲體內的熒光素酶.在相應化學反應中,熒光的產生是來自于螢光素的氧化,有些情況下反應體系中也包括三磷酸腺苷（ATP）.沒有熒光素酶的情況下,螢光素與氧氣反應的速率非常慢,而鈣離子的存在常常可以進一步加速反應（與肌肉收縮的情況相似）.[1]熒光生成反應通常分為以下兩步：
螢光素 + ATP → 螢光素化腺苷酸（luciferyl adenylate） + PPi
螢光素化腺苷酸 + O2 → 氧熒光素 + AMP + 光
這一反應非常節省能量,幾乎所有輸入反應的能量都被轉化為光.與之形成鮮明對比的是人類使用的白熾燈,只有越10%的能量被轉化為光,剩余的能量都變為熱能而被浪費.
熒光素或熒光素酶不是特定的分子,而是對于所有能夠產生熒光的底物和其對應的酶的統稱,雖然它們各不相同.不同的能夠控制發光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發光反應.最為人所知的發光生物是螢火蟲,而其所采用不同的熒光素酶與其他發光生物如熒光菇（發光類臍菇,Omphalotus olearius）或許多海洋生物都不相同.在螢火蟲中,發光反應所需的氧氣是從被稱為腹部氣管（abdominal trachea）的管道中輸入.一些生物,如叩頭蟲,含有多種不同的熒光素酶,能夠催化同一熒光素底物,而發出不同顏色的熒光.螢火蟲有2000多種,而叩甲總科（包括螢火蟲、叩頭蟲和相關昆蟲）則有更多,因此它們的熒光素酶對于分子系統學研究很有用.目前研究得最透徹的熒光素酶是來自Photinini族螢火蟲中的北美螢火蟲（Photinus pyralis）.
蟲熒光素酶 luciferase
亦稱發光酶.是催化生物發光的酶系的總稱.它是光物質的冷水抽提物在氧中發光時,底物蟲熒光素被消耗以后殘余的對熱不穩定的高分子成分.現在對螢蟲相海螢以及發光細菌的蟲熒光素酶結晶物的研究得最多.它們屬于加氧酶（oxygenase）,不含金屬和輔酶.對于發光,有的酶必須以ATP等作為輔助因子,有的則不需要.其發光機制等已了解到可因種的不同而有很大的差異,蟲螢光素酶具有高度的特異性,一般僅作用于來自近緣種的蟲熒光素.當然,螢蟲、海螢的酶是不能互相代替引起發光的.海螢的蟲熒光素酶在干燥狀態下相當穩定,可以保存
雙熒光素酶報告基因測試∶ 結合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進的共報告基因測試技術
在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時 ,通常采用第二個報告基因來減少實驗的變化因素.但傳統的共報告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不夠便利,因為各自的測試化學,處理要求,檢測特點存在差異.Promega提供一種先進的雙報告基因技術,結合了螢火蟲熒光素酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試.雙熒光素酶報告基因測試系統,結合pRL載體系統,表達第二個報告基因海洋腔腸熒光素酶,在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試,快速,靈敏,簡便.系統還提供PLB裂解液,用來裂解在多孔板中培養的哺乳細胞,不需操作單個樣品.對于正在使用螢火蟲熒光素酶報告基因載體的研究人員.雙熒光素酶報告基因測試系統將使他們立即體會到該系統的便利.
介 紹
雙報告基因用于實驗系統中作相關的或成比例的檢測, 通常一個報告基因作為內對照, 使另一個報告基因的檢測均一化.檢測基因表達時雙報告基因通常用來瞬時轉染培養細胞,帶有實驗報告基因的載體共轉染帶有不同的報告基因作為對照的第二個載體.通常實驗報告基因偶聯到調控的啟動子, 研究調控基因的結構和生理基礎.報告基因表達活力的相對改變與偶聯調控啟動子轉錄活力的改變相關,偶聯到組成型啟動子的第二個報告基因,提供轉錄活力的內對照, 使測試不被實驗條件變化所干擾.
通過這種方法, 可減少內在的變化因素所削弱的實驗準確性, 比如, 培養細胞的數目和活力的差別, 細胞轉染和裂解的效率.
使用螢火蟲熒光素酶,結合氯霉素乙酰轉移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的雙報告基因,近幾年已普遍使用.但這些雙報告基因組合削弱了熒光 素酶操作的優勢 , 比如熒光素酶測試和定量可在幾秒鐘內進行, 但CAT, β-Gal和GUS測試法, 則在定量前需要長時間的保溫.另外,這些報告基因受限于它們的靈敏度和線性應答范圍, 必須注意不要超過這些范圍, 內源性細胞活力也會干擾這類報告基因的使用.許多類型的細胞有內源β-Gal或GUS表達, 不利于準確定量報告基因表達, 胞內去乙酰酶活力干擾CAT活力測試.盡管在高溫下預處理細胞裂解液(1,2), 會降低內源性β-Gal和CAT測試的干擾,但這些處理也會快速失活熒光素酶.因此,在此類雙報告基因檢測中, 必須以不同的步驟分別處理共轉染的細胞裂解液.
理想的雙報告基因方法應該使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度,靈敏和線性范圍對同一樣品中的兩個報告基因同時測定.這在傳統的報告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它們測試化學,處理要求所固 有的局限.相反 , 結合螢火蟲 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔腸 ( Renilla reniformis ) 雙熒光素酶, Promega 的雙熒光素酶報告基因測試 (DLR) 系統可滿足這些要求,在單管中完成這些測試.
雙熒光素酶報告基因測試化學
熒火蟲和海洋腔腸熒光素酶都具有生物發光報告基因的卓越的測試特點 , 但它們在進化上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶學結構和底物要求.這些差別用來發展了 DLR 測試化學 , 選擇性地區別這兩種發光報告基因的活力.螢火蟲熒光素酶是一個 61kDa 單亞基蛋白質 , 酶活力不需翻譯后修飾 (3,4), 在翻譯后即可作為遺傳報告基因.在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下,通過甲蟲熒光素的氧化反應發光 ( 圖 1) .在常規反應條件下 , 熒光素的氧化發生時 , 以熒光素 -AMP 作為中間體 , 轉換非常緩慢.結果 , 在底物和酶混合后 , 測試化學產生"閃爍"的光 , 并迅速衰減.ZL化的測試試劑 , 定量螢火蟲熒光素酶活力 , 摻入了輔酶 A(CoA), 增強快速酶轉換來提高反應動力學 (5), 導致持續的"閃爍"發光信號 ( 圖 2) .
圖 1由螢火蟲和Renilla熒光素酶催化的生物發光
海洋腔腸熒光素酶,一個 36 kDa單亞基蛋白質,純化自天然來源的 Renilla reniformis (6),含有3%的碳水化合物,但是和螢火蟲熒光素酶一樣,酶活力不需翻譯后修飾,在翻譯后即可作為遺傳報告基因.海洋腔腸熒光素酶所催化的發光反應,利用O 2 和海樣腔腸熒光素(coelenterazine) (圖1).當用DLR測試化學作實驗時,海洋腔腸熒光素酶反應的動力學產生閃爍型發光信號,在檢測過程中緩慢地衰減(圖2).
在 DLR測試系統中,用單個裂解液分步測定螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶活力.在完成螢火蟲熒光素酶活力("實驗"報告基因)的測定后,螢火蟲發光被快速湮滅,并同時激活海洋腔腸熒光素酶的發光反應("對照" 報告基因).因此,DLR測試系統整合了兩個測試化學,對共表達的兩個報告基因作快速地定量,酶來自轉染細胞裂解液,或無細胞轉錄/翻譯反應.
螢火蟲熒光素酶測試的線性范圍延伸達酶濃度的8個數量級,可測定≤1fg (大約10 -20 摩爾)的實驗報告基因酶(圖3A).用雙熒光素酶報告基因測試系統, 海洋腔腸熒光素酶的線性范圍達酶濃度的7個數量級,較低的底限是≤ 10fg (大約3×10 -19 摩爾)的對照報告基因酶(圖3B),并且這兩個酶的特異活力相似.
圖 2 用雙熒光素酶報告基因測試由螢火蟲和Renilla熒光素酶產生的發光.CHO細胞(1×10 6 /60mm培養板)共轉染pGL3
Control和pRL SV40載體DNA.細胞用PBS洗滌后,加入400μl PLB制成裂解液.將20μl小量細胞裂解液和100μl熒光素酶測試試劑II(LARII)混合,螢火蟲熒光素酶的活力立即用熒光照度儀檢測(細線示蹤).100μl Stop &Glo TM 試劑加入到熒光照度儀管中,湮滅螢火蟲熒光素酶反應,同時激活Renilla熒光素酶反應,并立即檢測Renilla熒光素酶的活力(粗線示蹤).Turner Designs 型號20/20熒光照度儀配有計算機用來示蹤熒光發射,12秒內完成兩次測試.
雙熒光素酶報告基因測試系統的方式
定量兩個報告基因熒光素酶的發光信號,可在制備裂解液后立刻進行, 不需將樣品分成小組分或作額外的處理.因海洋腔腸和螢火蟲熒光素酶均呈現閃爍型反應動力學,作雙熒光素酶報告基因測試不需要有試劑注射器的熒光照度儀.
通常DLR測試,大約需要30秒鐘完成,如圖4所說明.起始螢火蟲熒光素酶報告基因測試時,將一份裂解產物和熒光素酶測試試劑II (LAR II)混合.在完成螢火蟲熒光素酶測試時,此時螢火蟲發光被湮滅,同時激活海洋腔腸熒光素酶的發光,加入Stop & Glo TM 試劑到樣品管.在1秒鐘內,Stop & Glo TM 試劑湮滅大于10 5 滴度螢火蟲反應的發光信號(圖5),并同時激活海洋腔腸熒光素酶.
圖 3 螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶發光反應的線性范圍.純化的螢火蟲和Renilla熒光素酶連續地用含1mg/ml BSA的1×PLB稀釋,配有計算機的Turner Designs熒光照度儀用來檢測10秒鐘的總熒光,在最初2秒的預讀延遲后.直接檢測高濃度的兩種熒光素酶的發光反應時,在熒光照度儀的樣品室中加入中性密度濾光片.在含10fg和100fg的Renilla熒光素酶反應中測試發光,需減去來自海洋腔腸熒光素自發光的背景信號.兩種熒光素酶的發光活力對各自的測試變化濃度作圖.
圖 4 用手工熒光照度儀或配有試劑加樣器的熒光照度儀的雙熒光素酶測試方式.如熒光照度儀配有兩個加樣器,將裂解液預先分裝到熒光照度儀的管子中,隨后按序自動加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II) , Stop & GloTM 試劑.
PLB裂解液
PLB裂解液 (Passive Lysis Buffer),經特別設計可有效裂解培養的哺乳細胞,而不必刮下貼壁細胞或作凍融循環.盡管PLB設計應用于被動裂解過程中,但它可靠的裂解效果同樣有益于使用常規處理方法制作的裂解液.無論使用何種裂解方法,對培養的哺乳細胞而言,釋放到PLB裂解液中的螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶報告基因酶是定量和可靠的 (圖6).被動裂解液的一個明顯優點,是可以抑制低水平的非酶促發光 (自發光),這是海洋腔腸熒光素在水溶液中的固有特點.通常用來制備細胞裂解液的試劑可增強海洋腔腸熒光素自發光,包括Triton? X-100, Promega的細胞培養裂解試?(CCLR) 和報告基因裂解試劑(RLB),這些試劑還會顯著抑制海洋腔腸熒光素酶的發光反應.PLB經特別設計用來最大地增強熒光素酶活力,使自發光減弱到最低,可提供最優的測試靈敏度,定量很低水平的海洋腔腸熒光素酶.另外,PLB抑制發泡,非常適合高通量應用,可用于自動化系統中將培養在多孔板中的細胞組制備成裂解液并測試.
圖 5雙熒光素酶報告基因測試系統湮滅螢火蟲熒光素酶發光和激活Renilla熒光素酶發光.CHO細胞裂解液有共轉染pGL3 -Control和pRL SV40載體DNA,按圖2描述的方法制備.螢火蟲熒光素酶(報告基因1) 和Renilla熒光素酶 (報告基因2) 活力檢測在10秒內完成,最初有2秒的預讀延遲.為了顯示Stop & Glo TM 試劑湮滅報告基因1的高效率,加入等體積的Stop & Glo TM 試劑 (缺少海洋腔腸熒光素無法激活Renilla熒光素酶反應),螢火蟲熒光素酶發光被湮滅而又不激活Renilla熒光素酶發光.在這一實驗中,湮滅螢火蟲熒光素酶反應的殘留發光,小于未湮滅反應值的0.0004%