1、在“超凈臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養基表面。要求涂布均勻致密。）
2、以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6mm、外徑8mm、高10mm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，并在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待幾分鐘后，分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養8-18小時，觀察結果。
3、將平皿培養基置于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。