藥物和藥物代謝
薄層色譜法在合成藥物和天然藥物中的應用很廣。有些文獻和內容偏重于合成藥物、化合物及其代謝產物，有文獻為在中草藥分析中的應用。每一類藥物，例如磺胺、巴比妥、苯駢噻嗪、甾體激素、抗菌素、生物堿、強心甙、黃酮、揮發油和萜等，都包括幾種或十幾種化學結構和性質非常相似的化合物，可以在上述文獻中找出一、二種全盤的展開劑，一次即能把每一類的多種化合物很好地分開。藥物代謝產物的樣品一般先經預處理后用薄層分析，應用也很廣，但有時因含量甚微，不用采用氣相和高效液相色譜法靈敏。
化學和化工
化工和化學方面的有機原料和產品都可用薄層色譜法分析。例如含各種功能基的有機物，石油產品，塑料單體，橡膠裂解產物，油漆原料，合成洗滌劑等，內容非常廣泛。
醫學和臨床
薄層色譜法的應用還滲透到醫學和臨床中去，例如它是一種快速的診斷方法可用于妊娠的早期診斷。方法是基于在孕婦的尿中能檢出比未媳婦婦女的尿中含更多的孕二醇，把兩者的尿提取后點在薄層上比較，即可作出判斷。這一方法可不用動物而在2~3小時內化驗出結果。
毒物分析和法醫化學
如前所述，經典的毒物分析有許多缺點，毒物分析和法醫化學采用薄層色譜法等新的手段，對麻醉藥、巴比妥、印度大麻、鴉片生物堿等均可分析。
農藥
十多種有機磷農藥和六種有機氯農藥都可在硅膠G薄層上分開并測定含量，可用于農藥分析及其殘留量分析。