藻類多糖的結構與生物活性研究實驗_高效液相層析法

大型藻類

NaNO；Na2HPO4?12H2O；EDTA

偏光光度計；高效液相色譜儀

（1）多糖的純化是將離心分離出的1000 ml培養液，用40℃真空濃縮到50 ml，再移入到透析袋內于4 ℃蒸餾水中透析三天。早晚更換一次蒸餾水，將透析袋內液體倒入燒杯，邊攪拌邊加入4倍體積99%乙醇，4 ℃過夜。11000 r/min離心得到沉淀，冷凍干燥獲得粗多糖。經DEAE-sephacel柱層析，0～2 mol/L氯化鈉梯度洗脫進一步純化，純度以醋酸纖維薄膜電泳法^[1]鑒定。
 
（2）分子量的測定是使用TSK-GEL.G300SWXL（7.8 mm×300 mm柱）GPC的高效液相層析（HPLC）法。移動相為1%三己基胺，檢測使用示差屈折計（YRU-880RI-UI檢測器），同樣條件下以Pulluna-ShodexSTANDARDP-82（分子量分別為5.9，11.8，22.8，47.8，112，212，404，788 kU）為標準。
 
（3）粘度使用TokimecEMD回轉粘度計測定，測定條件為25 ℃，回轉錐形種類是1°34′，糖濃度為0.5%。
 
（4）旋光度使用JASCO.DIP-370偏光光度計測定，測定條件是16.9 ℃，糖濃度是0.24%。
 
（5）元素分析采用的是原子光譜吸收法。
 
（6）硫酸基定量采用Rhodizonicacid法^[2]。
 
（7）薄層層析是將多糖完全水解后，取0.5 ml過微量樹脂Dowex1（乙酸型）柱，先用純水洗脫，收集中性部分，再用0.2 mol/L乙酸洗脫，收集酸性部分，點樣于硅膠板（Kieselgel60，10×10 cm）上，使用展開劑（醋酸乙酯∶醋酸∶水=2∶1∶1）展開，50%硫酸噴霧后，100 ℃使其炭化，根據炭化斑點的 Rf 值鑒定糖類。
 
（8）氣相層析是把多糖1 mg用三氟乙酸完全水解后，制成糖醇-乙酰化誘導體后進行的，實驗條件為TC-I柱（0.25 mm×20 mm），氣化室溫度：230 ℃，柱溫：140～210 ℃，以1.3 ℃/min升溫，載氣為氮氣，氫離子炎檢測。
 
（9）糖醛酸的定量采用Sulfatedacid-carbazole反應法^[3]測定。
 
（10）H1-NMR光譜分析是將純多糖溶解于重水，冷凍干燥，重復兩次，以丙酮δ2.23為內部標準。光譜是在用質子照射和費林變換裝備完全的INOVA-600光譜儀，600 MHz、20 ℃條件下測定的。
 
將不同組分的多糖或寡糖進行生物活性分析，有活性的進行結構分析。

[1] Nihonkagakukai , Saccharo-chemstry (lower) , Tokyoukagakudojin, 148～149 , 1976
[2 ] Louis J . Silverstri , Analysis of sulfate in complex carbohydrates, Ana . Biochen ., 123 , 303～309 , 1982
[3 ] Midori K . Physics and Chemistry Dictionary , IwanamiBookshop , 47 , 1981