蛋白分離純化步驟

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：
（一）材料的預處理及細胞破碎
分離提純某一種蛋白質時,首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態,不喪失活性.所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎.常用的破碎組織細胞的方法有：
1.機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用,使細胞破碎.常用設備有,高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等.
2.滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎.
3.反復凍融法
生物組織經凍結后,細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破.這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法.
4.超聲波法
使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎.
5.酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等.
(二)蛋白質的抽提
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來.抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定.如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100 等）,使膜結構破壞,利于蛋白質與膜分離.在抽提過程中,應注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質的變性.
（三）蛋白質粗制品的獲得
選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來.比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離.常用的有下列幾種方法：
1.等電點沉淀法
不同蛋白質的等電點不同,可用等電點沉淀法使它們相互分離.
2.鹽析法
不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出.被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質,并能再度溶解而不變性.
3.有機溶劑沉淀法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數比水低.能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低,進而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質.此外,有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層,促使蛋白質分子變得不穩定而析出.由于有機溶劑會使蛋白質變性,使用該法時,要注意在低溫下操作,選擇合適的有機溶劑濃度.
（四）樣品的進一步分離純化
用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質,須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品.常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等.
有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品.