蛋白質的純化實驗

Sephacryl S-300膠體

緩沖液buffer A-150

色析管柱 鐵夾 試管 鐵架 水平儀 收集器 濃縮用離心機  濃縮用離心管

一、儀器設備

色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6x100 cm）、鐵架、鐵夾及水平儀；部分收集器（fraction collector, 需準備干凈試管約100 支）；濃縮用離心機 （低速5,000 rpm）；濃縮用離心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 請注意其使用方法。
 

二、藥品試劑

膠體Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 預先以緩沖液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的膠體體積，占全部體積的七至八成；要先預估好膠體的使用量。b. 膠體溫度要與操作場所的溫度一致，否則溫度變化會產生氣泡。c. Sephacryl 系列膠體有相當大的吸附力，因此要在緩沖液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非專一性吸附。Buffer A-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合 （Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每組取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1 350）
 

三、管柱裝填
 

1.  以純水沖洗玻璃管柱 （以純水上下沖洗即可，嚴禁使用試管刷）；并請了解管柱的構造與拆裝方法，垂直架好管柱，以軟管連接部分收集器，并以bufferA-150 試看管路是否通暢；可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管，則可控制溶離的進行。 注意系統的擺設要適當，不要裝置于交通要沖。
 

2.   依預估量取出Sephacryl 膠體，注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡；將瓶中的膠體上下震蕩，使的完全懸浮，但勿產生太多氣泡。
 

3.   在管柱內加入約10 cm 高緩沖液，然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱，一直加到管柱頂端，開始流洗后膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時，可于頂端添加膠體，以達所要高度；膠體高度約90 cm。
 

4.  膠體完全沈降后，小心以buffer A-150 加滿管柱，關閉出口，裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶，打開出口以重力流洗。 調整緩沖液瓶高度，使流速約每五~六秒一滴，并設定收集體積為2.5 mL/tube。
 

5.   膠柱流洗約100 mL 后，關閉出口，拆開頂端端蓋，先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1 cm 高，注意勿破壞膠體表面平整； 然后打開出口，使液面下降至膠體面，再關閉出口，準備注入樣本。
 

四、樣本色析進行
 

1.   以微量移液器或滴管吸取樣本 （樣本體積不得超過膠體總體積的3%），沿著膠體上方管壁緩慢加入，注意切勿破壞膠體的平整表面！（樣本確實體積 _______ mL）
 

2.  打開出口，同時開啟部分收集器；當樣本完全沒入膠體時，關閉出口，緩緩加入與樣本相等體積的buffer A-150，打開出口待其慢慢進入膠體中，如此重復二次。不得擾動膠體表面，造成凹陷。
 

3.   暫時關閉出口，將液面高度加滿至管柱頂端，并把頂端端蓋鎖上；然后打開出口開始溶離，調整緩沖液瓶的高度，使流速為6 s 一滴。
 

4.   要留心觀察前面幾個分劃，確定整個系統運轉無礙，小心部分收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜，收集約80 管。

10） 收集試管，進行蛋白質定量分析以及GUS 活性測定，并請作圖。
 

5.   收集GUS 活性區，以Centriprep-30 濃縮至10 mL 后，加buffer A-0 稀釋至20 mL,再次濃縮至 _______ mL （GF），保留100 uL。
 

6.  管柱請再以buffer A-150 流洗100 mL 后，小心放置一旁，準備以后進行分子量測定。
 

五、分子量測定
 

1.   進行分子量測定前一天，請先以buffer A-150 流洗100 mL，并檢查膠柱內有無氣泡產生，若有嚴重的氣泡或干裂，必須重新裝填管柱。
 

2.   取標準分子量溶液0.4 mL,加上純質目標酶0.5 mL （以親和層析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻開始進行膠體過濾，并收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。
 

3.  收集所得，進行蛋白質定量分析，可定出數個蛋白質尖峰，以作為分子量依據；另以目測法，決定紅色高峰的管數，則可定出vitamin B12的溶離管數。利用以上數據，可畫出分子量與溶離管數間的直線關系，作為分子量判定的標準校正線。
 

4.   同樣的一批分劃，請進行酶活性分析 （GUS），則可定出酶的溶離體積，對照上述標準校正線，則可求出酶的分子量。
 

六、拆除管柱及保存膠體
 

1.   若管柱長期不用，應當自管柱中取出膠體，以緩沖液清洗后，置冷藏室中保存，但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊，有時可能不易取出，要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。
 

2.   膠體可以加0.01% NaN₃防止霉菌生長，但使用前記得要洗去；再度使用時，請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒，若有結塊而不易打散者，也不要使用。