在評價樣品純度之前，首先需要鑒定待測雜質的類型，如核酸、碳水化合物、脂質、無關蛋白質、同工酶類、失活蛋白質，進而確定在特定溶液條件中, 能夠區分假定雜質和目標蛋白質的理化特性 (化學分析或物理特征）。而純度則是指待測雜質含量低于某個特定水平。需要注意的是，上述說明中并沒有要求描述雜質的性質。純化過程可能已將某一雜質的濃度降低到檢測下限以下，但色譜峰中還有殘留。毫無疑問，表觀純度取決于所選擇的測定方法及其靈敏度。由于大多數分離方法都能夠有效地去除非蛋白質類雜質，因此本章節將主要介紹蛋白質樣品中蛋白質類雜質的檢測方法。有關核酸、脂類、碳水化合物雜質的檢測方法在本系列其他卷中有所介紹。
隨著蛋白質類生物制品的流行, 蛋白質純度已經成為藥品管理的重大問題。人用藥品注冊技術要求國際協調會 (TheInternationalConferenceonHarmonisation,ICH) 關于生物制品的質量指導原則（ICHQ6B，1998) 中考慮到了原料藥（基體材料，bulksubstance) 和藥物產品 (藥物劑型或成品）中的雜質成分, 并認可了生物分子（如蛋白質）的固有異質性 (inherentheterogeneity)。指導原則中闡明：「除了評價原料藥和藥物產品的純度可能由預期產品和多種產品相關物質組成——之外，制造商還應評價可能出現的雜質成分。這些雜質可能是過程相關或者產品相關, 它們可能是結構已知的、部分定性的，抑或是未經鑒定的。」該指導原則進一步區分了過程相關的雜質（由生產過程產生，包括宿主細胞蛋白質、宿主細胞 DNA、細胞培養誘導物、抗生素以及其他下游生產過程產生的雜質) 和產品相關雜質，包括生產或儲存過程產生的分子變異體（molecularvariant), 這些分子變異體在活性、有效性和安全性等特性上都無法達到預期產品的效果。」該指導原則認可了上述的分析能力。例如，有關原料藥指導原則中提到「生物工程制品和生物制品的絕對純度很難測定，結果往往依賴于所選擇的測量方法……因此，通常將多種方法結合來評價原料藥的純度。選擇和優化分析過程，應該著重考慮目的產品與產品相關物質以及與雜質的分離。」有關藥物產品的討論類似于原料藥，但是還介紹了產品降解以及由于輔料 (excipient) 干擾而造成的產品相關雜質的測定方法。
目前有一些高靈敏度的方法可用于檢測樣品中的雜質 (表 38.1)。其中每種方法測定分子的一種特定物理特性。方法的選擇依賴于以下標準:①可用于檢測的蛋白質的量；②待測雜質的性質;③所需的檢測精度;④所需的檢測靈敏度;⑤可能干擾到該方法的蛋白質及其溶劑特性。最為簡單和常用的方法是，經一次或多次分離后證實只有一種組分可被檢測到。若純度標準為只可以存在一種可檢測物質，則需用多種分離手段檢測雜質。
當所選擇的某種檢測方法無法從主要分析物中分辨出一種未知雜質時，推薦使用正交的方法 (orthogonal)。最后，謹慎處理樣品非常重要，這樣可以防止在制備分析所用的樣品過程中改變其雜質譜。并且，潔凈的環境、適宜的溫度及適當材質的容器都會為分析提供幫助。
很多合適的方法已經在本卷中的其他地方詳細介紹，這里不再贅述。有一些分子質量或分子大小的檢測方法在本卷其他章節也有概述，因此在本章的討論中，有時會引用/參考相關章節的細節 (Rhodesetal.,2009)。本章的重點將放在介紹更適用于檢測雜質而不是定量測定大小、質量等其他分子參數的方法上。此外，本章還概述了方法選擇的原則, 一些方法的局限和優勢, 并描述了一些不涉及分離的純度測定方法。
一些方法能夠量化氨基酸、特定輔基團或活性位點的摩爾數，可以用來評價蛋白質樣品的純度。如果已知純蛋白質的活性，那么單位活性測量可以用來檢測相對純度。這些方法是間接的，因為總要將分析物假設為不含雜質的純品，并將該假設純品的量作為參照。這些方法主要適用于純化過程早期的多相系統，或適用于需要特殊環境來保持活性的分子 (如膜蛋白）。一般需要檢測兩項: 第一項是分析所用樣品中蛋白質 (或原料）的總量; 第二項是定量已知的活性對象或其他特殊的分析對象。然后根據蛋白質的總量，計算出相應的預期分析對象的量。純度則以分析對象的測定量和預期量的比值表示。使用末端基團分析法（Chang,1983)、特殊輔助基團定量分析法和酶活定量分析法（Biggs，1976) 等都可以非常好的量化純度。本方法的詳細信息 Rhodes 等（2009) 在本書中有介紹。
蛋白質的組成和活性分析僅能說明是否有雜質存在，通常很少能提供有關雜質的性質信息 (如大小和電荷）。除非雜質干擾到測定過程或蛋白質活性，活性檢測可能無法提供有關雜質的任何信息。因此，實驗者無法得到足夠線索以去除雜質。
電泳法提供了最簡單、成本最低，并且在確定樣品中蛋白質組分數目方面靈敏度最高的手段，因此最為常用。由于成本極低且相當簡單，這些方法常被用做蛋白質純度第一步篩選，甚至應用于初期高異質性的樣品。本書中其他章節介紹了 SDS 凝膠電泳以及利用電泳測定分子質量和大小的方法 (Rhodesetal.,2009)。這些方法都可以單獨測定樣品的純度，方法的選擇取決于希望檢測待測蛋白質的何種性質 (表 38.1)。如果預期雜質與目標蛋白質分子質量有差距，SDS 凝膠電泳可以分辨出雜質。對于分子質量相近但氨基酸組成不同的分子，SDS 凝膠電泳一般不能區分，但是在非變性凝膠電泳中它們有不同的電泳遷移率。另外，幾乎任何大小的蛋白質都可以通過等電聚焦法分離。有關等電聚焦法在本書的其他章節中有所介紹 (Friedman,2009), 這里不做詳述。
根據采用的電泳檢測方法的類型, 所需樣品量從納克級到微克級。由于每種雜質在特定樣品中占據固定的質量分數 (weightfraction)，而雜質的檢測依賴于其總量，因此上樣量過載的膠也許能夠更有機會檢測到某種雜質。然而，樣品上樣量的上限取決于樣品溶解度，并且需要基于分辨率的考慮 (Lunneyetal.，1971)。一般后者的限制性更強，因為樣品濃度較高或者大體積樣品量會導致譜帶擴張和變形。由于過載造成的譜帶擴張將難以分辨具有相似電泳遷移率的雜質。然而，電泳這種最靈敏的譜帶檢測方法 (需要的樣品量最小) 不適于回收樣品。如果蛋白質樣品已變性或者已在極端條件下溶解，一般很難再回收活性蛋白質。如果使用的是非變性電泳，則可通過電泳提取（electirophoreticextraction) 從凝膠中回收樣品（Friedman,2009;Garfin,2009)。但是變性電泳可能無法回收天然蛋白質 [例外請參見 Burgess,(2009)]。復性成功與否很大程度上取決于蛋白質的結構。較大或多亞基的蛋白質恢復天然構象的可能性比小單體蛋白質要小。