質粒轉染大腸桿菌

細胞株質粒

鏈霉素青霉素FCSPBS胰酶EDTA轉染試劑(Lipofectamine TM2000)胰化蛋白胨酵母提取物瓊脂NaClNaOH氨芐青霉素卡那霉素質粒提取試劑盒

高壓滅菌鍋42℃恒溫水浴鍋恒溫搖床無菌培養板消毒1.5ml離心管消毒槍頭無菌操作臺

一、轉染

1. 從-70℃ 冰箱中取 200μl 感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。

2. 加入質粒 DNA 溶液（含量不超過 50ng，體積不超過 10μl），輕輕搖勻，冰上放置 30 分鐘后。

3.42℃ 水浴中熱擊 45s/90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻 3-5 分鐘。

4. 向管中加入 1 mlLB 液體培養基（不含 Amp），混勻后 37℃ 振蕩培養 1 小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。

5. 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp 的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃ 培養 16-24 小時。

6.在轉染的同時應做兩個對照：

對照組 1：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的 LB 平板上應沒有菌落出現。

對照組 2：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，但涂板時只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。

二、轉染大腸桿菌的擴增

1. 從 LB 平板上挑取新活化的單個菌落，接種于 3-5 mlLB 液體培養基中，37℃ 下振蕩培養 12 小時左右，直至對數生長后期。將該菌懸液以 1：100-1：50 的比例接種于 100 mlLB 液體培養基中，37℃ 振蕩培養 2-3 小時至 OD600＝0.5 左右。

2. 取上述培養液置于冰中 10 min，之后轉移到已滅菌的 50 ml 離心管中再于冰上放置 5 min

3. 于 4℃ 離心，2700rmp，10 min，棄上清，收集細菌

4. 質粒的提取

準備大腸桿菌質粒提取盒和擴增的帶質粒大腸桿菌培養液

5. 質粒鑒定（瓊脂糖凝膠電泳）

三、質粒轉染細胞株的建立

1. 準備細胞：

貼壁細胞：轉染前 24 h，在 500 uL 無雙抗完全培養基中接種 0.5~2×10⁵個細胞，轉染時細胞融合度為 80 ~ 90% 。 

2．對于每個轉染樣品，按下面的方法準備：

（1）用 50 uL Opti-MEM 稀釋 0.8 ug 質粒 DNA，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 5 min。

（2）輕輕顛倒混勻轉染試劑，用 50 uL Opti-MEM 稀釋 2.0 uL Lipofectamine TM2000，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 5 min。

（3）混合轉染試劑和質粒 DNA 稀釋液，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 20 min。注: 轉染復合物一旦形成，應立即加入培養皿中進行細胞轉染。

（4） 轉染復合物加入到 24 孔細胞板中，100 uL/孔，前后輕搖細胞板混合均勻。

（5） 將細胞板置于 37℃、5% CO₂培養箱中培養 6 h 左右，進行換液，換成含 10% 血清的普通培養基，在 37℃，5％CO₂ 孵育箱中繼續培養 24 h 左右。

四、穩定轉染細胞株的篩選

1.從 37℃，5％CO₂孵育箱中取出培養皿，棄去含轉染試劑的培養基，用 PBS 沖洗細胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接種 1/2 的細胞到 100 mm 培養皿中，加入含 500 ug/ml G418 的新鮮培養基，每 2-3 天更換一次新的篩選培養基，每天觀察細胞的死亡情況。

2.當正常細胞完全死亡后，換用新的不含 G418 的培養基培養。每天觀察細胞生長狀態。

3.在細胞達到 60% 匯合率時再用含 500 ug/ml G418 的培養基篩選一次。

4.當細胞達到 90% 以上匯合率時將細胞轉移至培養瓶中繼續培養（轉染后 10~12 天左右）。以后每隔 4~5 天再用含 500 ug/ml G418 的培養基篩選。

5.直到穩定表達轉染質粒的細胞達到一定數量后可以收集樣品（約轉染后 15 天左右）。以后繼續培養時加入的 G418 濃度降一半。

鋪板時要將細胞消化完全混勻，避免細胞堆積生長。

1.LB 培養基的配制：在 950 ml 去離子水中加入：胰化蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl10 g，搖動容器直至溶質溶解。用 5mol/LNaOH 調 pH 至 7.0，用去離子水定容至 1L，在 15psi 高壓下蒸汽滅菌 20 min。

2.LB 固體培養基及倒板：

（1）配制：100 mlLB 培養基加入 1.5 g 瓊脂粉

（2）抗生素的加入：高壓滅菌后，將融化的 LB 固體培養基置與 55℃ 的水浴中，待培養基溫度降到 55℃ 時（手可觸摸）加入氨芐抗生素（終濃度為 50 μg/ml），以免溫度過高導致抗生素失效，并充分搖勻。

（3）倒板：一般 10 ml 倒 1 個板子。培養基倒入培養皿后，打開蓋子，在紫外下照 10-15 分鐘。

（4）保存：用封口膠封邊，并倒置放于 4℃ 保存，一個月內使用。