實驗原理：
限制性內切酶（restriction endonuclease,
RE）能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。限制性內切酶可分為三類：I、Ⅱ和III類。I類和III類酶在同一蛋白質分子中兼有修飾（甲基化）作用和依賴于ATP的切割。I類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。I和III類酶在分子克隆中都不常用。
Ⅱ類酶由兩種酶組成：一種為限制性內切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列；另一種為獨立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。
絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4~6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5′-G↓AATTC-3′），有少數酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5′-CCC↓GGG-3′）；有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端，如EcoRⅠ切割識別序列后產生兩個互補的粘性末端。
5′…G↓AATTC…3′
3′…CTTAA↑G…5′
DNA限制性內切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內切酶酶切位點組成，以直線或環狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構建等工作中，建立限制性內切酶圖譜都是不可缺少的環節，限制性片段長度多態性
(RFLP) 技術更是建立在它的基礎上。
質粒DNA酶切片段的回收：DNA片斷的分離與回收是基因工程操作中的一項重要技術，例如可收集特定酶切片斷用于克隆或制備探針，回收PCR產物用于再次鑒定等。回收實驗中兩個最重要的技術指標是純度和回收率：前者未達標時會嚴重影響以后的酶切、連接、標記等酶參與的反應；后者不理想時往往會大大增加前期的工作量。
本實驗采用的是Axygen公司的AxyPrep
DNA凝膠回收試劑盒。該試劑盒從普通瓊脂糖凝膠中回收并純化DNA的原理是：在凝膠融化液（Buffer
DE-A）中凝膠塊被迅速融化并釋放出DNA。加入高鹽DNA結合液（Buffer
DE-B）后DNA片斷被選擇性吸附到silica膜上。經Buffer W1、Buffer
W2洗滌去除殘留在silica膜上的雜質和高濃度鹽離子后，吸附到silica膜上的DNA片斷經微量水或Eluent洗脫下來，即可用于各種分子生物學實驗。
實驗材料：
[1].實驗8獲得的GAPDH-T載體重組質粒DNA
[2].10×TBE緩沖溶液
[3].6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃
[4].10mg/ml溴化乙錠
[5].Sal I：MBI Fermentas Life Sciences
[6].Kpn I：MBI Fermentas Life Sciences
[7].瓊脂糖(Agarose)
[8].瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：Axygen公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒
[9].質粒DNA電泳儀，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，微量移液槍，微波爐，瓊脂糖凝膠成像系統。
[1].實驗步驟： NA酶切反應體系(30μl)組成為：
[2].簡單離心混勻。酶切反應在37℃保溫1~16h。
[3].將全部酶切液都加于1%瓊脂糖凝膠上，80V電泳適當時間。
[4].電泳后在紫外燈下，用酒精火焰滅菌的刀片將含目的條帶的凝膠切下，并將含DNA條帶的凝膠塊切碎，裝入滅菌的1.5ml eppendorf管中，稱重并記錄凝膠重量。
[5].按“凝膠重量（mg）：Buffer DE-A (μl) = 1：3”的比例，向凝膠塊中加入Buffer DE-A。
[6].75℃水浴保溫，期間每2~3min顛倒混合一次，至凝膠徹底溶化。Buffer DE-A為凝膠融化劑，也含DNA保護劑，防止DNA在高溫下降解。
[7].加0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻；當分離的DNA片段小于400bp時，加入1個凝膠體積的異丙醇。Buffer DE-B為結合液，可促使大于70bp的DNA片段選擇性的結合到DNA制備膜上。
[8].將溶液轉移到DNA制備管（置于2ml離心管）中，12000g離心1min，棄濾液；如果一次加不完，可分兩次離心。
[9].將DNA制備管置回離心管，加500μl Buffer W1，12000g離心30s，棄濾液。
[10].將DNA制備管置回離心管，加700μl Buffer W2（第一次使用前向Buffer W2 concentrate中加入瓶上指定體積的無水乙醇），12000g離心30s，棄濾液。
[11].將DNA制備管置回離心管，加700μl Buffer W2，12000g離心1min，棄濾液（去鹽）。
[12].將DNA制備管置回離心管，12000g離心1min（除去殘余酒精）。
[13].將DNA制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25~30μl Eluent （2.5mM Tris-HCl, pH8.5）或滅菌去離子水，室溫靜置1min；12000g離心1min，收集DNA。
[14].純化的PCR產物用瓊脂糖電泳法檢測，用紫外分光廣度計測定濃度。
注意事項：
[1].酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應。
[2].酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應條件下，1h完全降解1μg
λDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不像λDNA那樣易于降解，需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質可能干擾隨后的反應。
[3].市場銷售的酶一般濃度很大，為節約起見，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。
[4].觀察DNA離不開紫外透射儀，可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時，應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光切割DNA。
[5].EB是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。
[6].當EB太多，膠染色過深，DNA帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，30min后再觀察。
示例圖片：
泳道1：未酶切的質粒DNA；泳道2：BamH1酶切的質粒DNA；泳道3：Bgll酶切的質粒DNA；泳道4~9：Ddei、Dra1、EcoR1、HaeIII、HindIII酶切的質粒DNA。
瓊脂糖凝膠電泳分析經純化的質粒DNA