質譜分析技術原理與方法

質譜方法(Mass Spectroscope,MS)是通過正確測定蛋白質分子的質量而進行蛋白質分子鑒定、蛋白質分子的修飾和蛋白質分子相互作用的研究。質譜儀通過測定離子化生物分子的質荷比便可得到相關分子的質量。但長期以來，質譜方法僅限于小分子和中等分子的研究，因為要將質譜應用于生物大分子需要將之制備成氣相帶電分子，然后在真空中物理分解成離子。但如何使蛋白分子經受住離子化過程轉成氣相帶電的離子而又不喪失其結構形狀是個難題。20世紀70年代，解吸技術的出現成功地將蛋白分子轉化成氣相離子。爾后快原子轟擊與其緊密相關的溶液基質二次離子質譜法使得具有極性的、熱不穩定的蛋白分子可經受住電離過程。但這些方法僅限于10kD以下蛋白分子的研究。80年代電噴霧電離(ESI)和軟激光解吸(SLD)電離技術的發展則使得質譜方法應用于高分子量蛋白分子的研究。

電噴霧電離(ESI)原理可按電荷殘留模型予以描述，帶電液滴蒸發，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當液滴蒸發到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產生的小帶電液滴繼續此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發，就可獲得自由徘徊的質子化和去質子化的蛋白分子。針對電噴霧電離所產生的多電荷狀態，Fenn將多電荷狀態理解為對分子質量進行多次獨立的測量，并基于聯立方程解的平均方法，獲得對分子質量的正確估量，解決了多電荷離子信息的問題，使蛋白分子質量測量精度獲得極大的提高，并于1988年首次成功地測量了分子量為40 kD的蛋白質分子，精確度達到99.99%。

軟激光解吸(SLD)是指從激光脈沖中獲得能量后，樣品分子以完整的低電荷分子離子釋放，然后由電場加速。運用激光解吸電離蛋白分子時，激光的能量和波長、化學/物理基質的吸收和熱傳遞特性，與基質中分析物的分子結構之間需要作合理的選擇調配。Tanaka選用了低能量氮激光和含有膠狀顆粒的甘油作基質，成功地測定了高分子量的糜蛋白酶原、梭膚酶-A以及細胞色素。由于Tanaka成功的開創性工作，SLD技術迅速發展。目前占主導的方法是基質輔助激光解吸電離(MALDI)。這一方法是將樣品摻入一種低分子量的結晶基質，基質的最大吸收與激光脈沖波長匹配。由于MALDI產生的是低電荷的完整氣相大分子，可用于檢測純度不高的生物分子。MALDI與飛行時間(TOF)聯合已經成為鑒別大分子的重要方法，成為鑒定細胞內蛋白組分不可或缺的研究手段。