轉化畢赤酵母

實驗概要

本實驗介紹了畢赤酵母的轉化方法。

主要試劑

1. 轉化當天，配制下列試劑：存于4度

5% SDS溶液

RD(Regeneration Dextrose) 融化瓊脂100ml

2. 溶液：轉化試劑

40%PEG：用水配制40%(w/v)PEG3350(試劑純)

CaT：20mMTris pH7.5，20mM CaCl₂

SOS：1M山梨醇，0.3×YPD，10mM CaCl₂

3. 每次轉化時配制：

SED：19mlSE 加1ml 1M DTT

PEG/CaT：1:1混合40%PEG及CaT

實驗材料

GS115中，用SalI，StuI或SacI線性化的DNA可分離His Mut 重組子

KM71中，用SalI，StuI或SacI線性化的DNA可分離His Muts重組子

親代載體用相同酶線性化

對照包括無DNA，線性化PBR322DNA及質粒(無細胞)涂板來檢測是否有污染

實驗步驟

1. 程序：

   1) 將RDB平板放于室溫，準備好融化的RD上層瓊脂，取出線性化DNA置于冰上。

   2) 取100ul去壁細胞到1.5 ml滅菌的有蓋管中。

   3) 取10ugDNA，室溫孵育10min。

   4) 同時配制PEG/CaT溶液，計算所需用量，加入等量的40%PEG/CaT(1:1)。

   5) 加1ml新鮮的PEG/CaT溶液至細胞與DNA混合物中，輕輕混勻，室溫孵育10min。

   6) 室溫750g離心10min，小心抽吸PEG/CaT溶液，顛倒管，輕叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。

   7) 用150ulSOS培養基懸浮轉化細胞，室溫孵育20min。

   8) 加入850ul1M山梨醇，接下來涂板。

2. 涂板：畢赤酵母去壁細胞需要鋪在頂層瓊脂糖或瓊脂上，以防止在選擇前被裂解

   1) 接第8步，取100-300ul去壁細胞-DNA，與10ml融化的RD瓊脂糖混勻倒于RDB平板上，直至上層瓊脂變硬。注意，確保有足夠的去壁細胞-DNA鋪第二板，第三板。

   2) 倒置平板，28-30度孵育，轉化子會在4-6天內出現。

   3) 細胞活性：用100ul去壁細胞加入900ul 1M山梨醇。

   4) 取稀釋樣本100ul，加入10ml融化的RDH，鋪在RDHB平板上，等上層瓊脂凝固。

   5) 倒置平板，28-30度孵育，4-6天出現克隆，表明去壁細胞可再生成分裂細胞。