轉基因植物的分子檢測與鑒定方法（一）

隨著分子生物學和植物基因工程的不斷發展，越來越多的育種工作者開始利用轉基因技術獲得常規育種技術難以得到的新種質和新品種。植物轉基因技術最大的好處在于可以打破自然界物種間原有的生殖隔離，促進基因在不同物種間的交流，極大地豐富變異類型，增大遺傳多樣性，為植物新品種的培育提供豐富的育種資源。通過對基因功能的研究，篩選目的基因，還可實現植物性狀的定向改良。因此該技術自1983年首次獲得轉基因植物以來，便深受育種工作者青睞，得到了蓬勃地發展。至今已有30多科約200多種植物轉基因成功；國際上相繼有30多個國家批準3 000多例轉基因植物進入田間試驗，并且在美國、加拿大、中國等20多個國家成功進行了商品化生產。轉基因作物品種在農業生產中日益顯現出巨大潛力。

植物轉基因操作中，除利用抗生素抗性和除草劑抗性等選擇基因排除非轉化細胞而留存轉化細胞，以及利用Gus和GFP等報告基因顯示轉基因成功外，更重要的是從分子水平鑒別出陽性轉化體，明確目的基因在轉基因植株中的拷貝數和轉錄與表達情況。本文就常用的轉基因植株檢測與鑒定方法做一概述，并對近期發展起來的新方法做簡要介紹。

1  外源基因整合與否及其整合拷貝數的鑒定

1.1 PCR(polymerase chain reaction)檢測

1.1.1  常規PCR

PCR技術對目的片段的快速擴增實際上是一種在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下利用DNA聚合酶的酶促反應，通過3個溫度依賴性步驟(即變性、退火和延伸)完成的反復循環。經PCR擴增所得目的片段的特異性取決于引物與模板DNA間結合的特異性。根據外源基因序列設計出一對引物，通過PCR反應便可特異性地擴增出轉化植株基因組內外源基因的片段，而非轉化植株不被擴增，從而篩選出可能被轉化的植株。

由于PCR檢測所需的DNA用量少，純度要求也不高，無需用同位素，實驗安全，操作簡單，檢測靈敏，效率高，成本低，使之成為當今轉基因檢測不可或缺的方法，被廣泛應用。然而，PCR檢測易出現假陽性結果。引物設計不合理，靶序列或擴增產物的交叉污染，外源DNA插入后的重排、變異等因素都會造成檢測的誤差。因此常規PCR的檢測結果通常僅作為轉基因植物初選的依據，有必要對PCR技術進行優化，并對PCR(real-time quantitative PCR)檢測為陽性的植株做進一步驗證。

1.1.2  優化的PCR

PCR技術的優化目的在于提高擴增產物的特異性、推測目的基因的拷貝數及整合情況，從而提高檢測的效率。常見的有多重PCR(Multiplex PCR， MPCR)、降落PCR(Touchdown PCR，TD-PCR)、 rpPCR、反向PCR(inverse PCR，IPCR)、實時定量 PCR等。

1.1.2.1  多重PCR

MPCR是在同一管PCR反應體系中，使用多套針對多個DNA模板或同一模板的不同區域進行PCR擴增的方法。與普通PCR法相比，MPCR反應更快捷，更經濟，只需1次PCR反應，就能檢測多個靶基因。由于MPCR技術是在同一反應管中加多對引物同時對多個靶位點進行檢測，因此對引物的要求較高，不同引物間的相互干擾應降至最低；同時擴增的目的片段大小也不能太接近，否則凝膠電泳時難以分開，無法辨別。