轉染細胞的穩定篩選實驗

轉染細胞

抗生素 培養基 胰酶

6孔板 24孔板 96孔板 CO2培養箱 濾紙片 培養瓶

1.確定抗生素作用的最佳濃度：

不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預試驗，確定抗生素對所選擇細胞的最低作用濃度。

1） 提前24 小時在96 孔板或24 孔板中接種細胞8 孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO₂ 孵箱中37℃培養過夜。

2） 將培養液換成含抗生素的培養基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000ug/ml）。

3） 培養10-14 天以絕大部分細胞死亡濃度為準，一般為400-800ug/ml,篩選穩定表達克隆時可比該濃度適當提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半。

2.轉染按前面的步驟進行。

3.轉染72 小時后按1:10 的比例將轉染細胞在6 孔板中傳代，換為含預試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養基。在6 孔板內可見單個細胞，繼續培養可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。

1） 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過胰酶，將濾紙片貼在單細胞集落上10-15 秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于24 孔板中繼續加壓培養。細胞在24 孔板中長滿后轉入25cm² 培養瓶中，長滿后再轉入75cm2 培養瓶中培養。

2） 有限稀釋法：將細胞消化下來后做連續的10 倍稀釋（10^-2-10^-10），將每一稀釋度的細胞滴加到96 孔板中培養，7-10 天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。

4. ELISA 或Western blot 檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。

1. 如為貼壁生長細胞，一般要求在轉染前一日，必須應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，轉染當日的細胞密度以70-90%（貼壁細胞）或2×10⁶-4×10⁶細胞/ml（懸浮細胞）為宜，最好在轉染前4h換一次新鮮培養液。

2. 用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其他化學物質的污染，OD260/280比值應在1.8以上。