過氧化氫酶的應用介紹

CAT來源豐富，幾乎存在于所有好氧生物中。但來自動物臟器以及一些微生物(如溶壁微球菌、球形紅假單孢菌、大腸桿菌、粗糙脈孢霉、微紫青霉、黑曲霉)的CAT，均不能忍受接近沸點的高溫和pH大于10的強堿性[3]。近20年來，關于嗜熱菌H’5]、嗜堿菌[6]或嗜熱嗜堿菌[7]產生凹汀的報道陸續出現，特別是嗜熱子囊菌所產的CAT是迄今為止已報道過的熱、堿穩定性最好的CAT【8]，為開發耐熱耐堿的G盯提供了可能。

本研究室在前期研究中，篩選得到了一株金黃色嗜熱子囊菌WSH 03—01(確刪伽觀￡，口“m磁妃協WSH 03—01)，該菌株發酵生產的CAT酶活較高，而且對熱和堿的穩定性都較好，在紡織清潔生產中具有良好的應用潛力。為了適應工業化生產的條件，本文在上述實驗室研究的基礎上，采用工業級碳源替代原先的試劑級碳源，在7L發酵罐上考察了其發酵生產已盯的可行性，在此基礎上，著重考察了溶解氧對發酵過程的影響，并驗證了發酵生產所得的Q盯對過氧化氫的去除效率，最后，在染整清潔生產中進行了應用試驗，取得了較好的效果。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1茵種

金黃色嗜熱子囊菌

1．1．2材料與儀器

全自動發酵罐KFT-7 L(Korea Fennentor CO．，

Ltd，韓國)。

1．1．3培養基

斜面培養基mA(每支茄式瓶)：6度麥汁30mL，瓊脂19，pH6．0。

種子培養基(g／L)：玉米淀粉15，蛋白胨4，酵母膏4，K2Ⅷ’04 1，Na2HP04 1，MgS04。7H20 5，pH6．8。

基礎發酵培養基(g／L)：玉米淀粉26，蛋白胨10，(NH)2S04 2，K2}Ⅱ氌5，KH2P04·3H20 3，Mg鼢·7H20 2，微量元素液2 mL，10rnL乙醇，pH7．O。

微量元素液(∥L)：FeQ H5 07·mO 6，Cacl2·2H20 4，Z蜘4‘7H20 2，MnCl2‘4H20 0．1，K1 0．1，(m)6M07Q4·4H20 0．1，C。C12·6H20 0．1，H38030．1，NaCl 5。

1．2實驗方法

1．2．1培養方法

1)搖瓶培養：將成熟的孢子接種到P【)A斜面上，45℃培養13～16d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養基中(培養基中孢子濃度為104個／mL)，45℃搖床培養52h。吸取種子培養液，按10％的接種量接種于基礎發酵培養基中(500mL搖瓶中裝100 mL培養基)，45℃搖床培養84 h。每項實驗均設三個平行樣。

2)發酵罐培養：將成熟的孢子接種到PDA斜面上，45℃下培養13～16d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養基中(培養基中孢子濃度為104個／mL)，45℃培養52h，再以7％的接種量接入發酵罐，從48h開始流加乙醇直至發酵結束，通氣量1：1，200r／nlin，52h后調整為350r／nlin。

1．2．2發酵液揮發量的校正

發酵過程在高溫下進行且周期較長，培養基中水分的揮發對實驗結果的準確性會有較大影響，因此在發酵結束后采用稱重補水法進行校正。將接種后的搖瓶用電子天平(0．019)記錄初始質量，發酵結束后，分別將去離子水補人相應搖瓶至初始值。恢復質量后的發酵液再用于發酵液各項參數的分析測定。

由于發酵罐發酵體積較大，故發酵結束后未對發酵液揮發量進行校正。

1．2．3生物量測定

取50 mL發酵液進行真空抽濾，收集濕菌體，用蒸餾水洗滌2次后，置105℃下恒溫干燥至恒重，用稱重法測定生物量。

1．2．4過氧化氫酶活性測定

采用分光光度法在25℃下測定[10|。反應總體積為3 mL，含0．1n1L酶液和2．9mL含有10 mmol／L H202的50 n蚰ol／L的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉緩沖液(pH 7．0)。過氧化氫的分解速率用752型紫外一可見光分光光度計在240 m下測定。酶活定義為：在上述條件下，每分鐘分解1肛m01 H202所需的酶量為一個酶活單位。

1．2．5還原糖的測定：3，5一二硝基水楊酸比色法[11|。

1．2．6總糖的測定：蒽酮比色法[12】。

1．2．7染整清潔生產實際應用工業化試驗

試驗地點：無錫天時針織有限責任公司

試驗樣本：150kg純棉布

傳統工藝：漂白(過氧化氫)一冷水洗(溢流，10rnin)一熱水洗(98℃，10 H1in)一冷水洗(5～10 rnjn)1～2次一染色。

酶法工藝：漂白(過氧化氫)一冷水洗(溢流，10rnjn)一酶處理(10L酶液，約1．5萬u／mL，20 rnin，60℃)一熱水洗(98℃，10刪n)一染色。

色差測試：采用上海精密儀器廠生產的WSeC型測色色差計測定

2結果與討論

2．1發酵工藝碳源的確定

前期研究表明，T．n亂m咒￡inc“s WSH 03—01對單糖和雙糖的利用較差，當以葡萄糖為碳源時，濃度超過4 g／L后產Q盯的濃度迅速降低，而當濃度達到20 g／L時，發酵終了時Q盯酶活極低(<10 u／mL)，且發酵液的pH均降至3以下[9J。與此相反，該微生物菌株以209／L英國膠(糊精的一種)作為碳源時，卻表現出良好的生長與產酶特性【9]。但是英國膠沒有工業化產品，不適合作為大規模生產的原料。因此，需要選擇一種適合于工業化的相近原料進行替代。

研究中選擇的碳源是常用的工業原料，在搖瓶條件下比較了不同碳源對產酶的影響。結果如圖1，兩種型號的糊精TF．AC0500和糊精SPO．M0350(由天津頂峰變性淀粉生產有限公司提供)的DE值(葡萄糖當量，DE值越高表示水解程度越高)與英國膠相似，且菌體生長無較大差異，但是其產酶效果與英國膠(209／L)相比降低了40％左右。麥芽糊精為碳源時菌體干重(DICW)比對照有提高，但對產酶作用不明顯。使用液化后玉米淀粉作為碳源時，酶活比對照下降了80％。相比之下，以糊化后的玉米淀粉為碳源時有利于菌體的生長，比英國膠和麥芽糊精的酶活分別提高了6％和50％。

從以上結果，可以認為溶解氧在T發酵產CAT中具有較為重要的影響。根據該微生物發酵產酶的周期特點，我們采用分段控制攪拌轉速的策略，以獲得不同的溶氧水平，即發酵前期攪拌轉速控制在200r／min，52h后提高到350r／min，在此條件下考察其發酵過程，結果如圖3所示。可以看出，發酵前52h菌體生長較快，轉速提高后菌體的生長速度有所降低，在74h達到最大值10．969／L；而T．口亂m，z￡缸c“s WSH 03—01合成Q盯的速度在經過53—63h的平穩期之后明顯加快，112h時CAT酶活力達到最大4505 u／mL，與不使用分段控制攪拌轉速發酵罐最高酶活1851 u／mL相比，酶生產率提高了2．4倍，DCW也從9．96∥L提高到了11．29／L，這一結果表明，分階段控制溶解氧在提高酶活與促進菌體生長方面具有明顯效果。

此外，對發酵過程中的pH變化考察可以發現，在45h前pH一直呈現下降的趨勢，這是由于碳源分解形成的酸性中間產物造成的，這也表明菌體處于旺盛的生長期。45h后pH開始回升，同時a盯合成速率也增加，pH的回升正好與產酶進入高峰期相對應，掌握這一特征現象在實際工業生產中是十分有利的。

上述結果表明，溶解氧是限制發酵產酶水平重要因素。結合已有的理論研究可以認為，首先，絲狀真菌在發酵過程中形成的菌球的大小對菌體的謝有較大影響nDl，培養液中的營養物質(包括溶氧)是通過菌球表面向內部滲透，在2．5 mm深度的范圍內，菌球內菌絲的生長和分枝不受限制，一旦超過2．5 mm，氧的攝人量不足將成為限制增殖的因素。

而溶解氧同時也是發酵過程能否形成理想的菌球形態的重要限制因素，在高溶氧的條件下，菌體更易形成理想的菌球。其次，研究表明提高溶氧水平所造成的氧化脅迫響應(Oxygen stDess f沁pond)也可以誘導菌體產酶。因此，為了提高菌體產酶，除了為菌體生長提供足夠的溶解氧外，還要維持一定水平的溶解氧誘導菌體產酶。

2．3本研究獲得的過氧化氫酶對過氧化氫的去除效果驗證

為了考察T，伽m咒￡如餓s wSH 03一01合成的CAT的應用潛力，進行了過氧化氫去除效果的驗證試驗，即配制濃度為100ppm的H202作為反應底物，選擇pH梯度分別為5．5、7．0、8．0，溫度梯度分另玎為15℃、30℃、40℃，按O．1％(v／v)的比例加入a汀液(約2000 u／n兒)，在反應10“n、15 rnin時分別測定H202殘留量，考察其去除H202的效果。

結果如表1所示。

2．4本研究獲得的過氧化氫酶在染整清潔生產中的應用試驗研究

在染整生產工段，漂白后的水中pH為11，按照其中過氧化氫理論量，Q盯的加人量以理論G盯酶量的1。2倍計。發現在酶作用8喊n之后水樣中已檢測不出過氧化氫。該結果表明使用T合成的氧化氫酶，在40℃、pHll的條件下對過氧化氫仍然具有良好去除效果。為了進一步考察其效果，又對酶處理后的布樣進行了染色性能的考察，即比較酶法處理后直接染

色、酶處理+熱水漂洗后染色、酶處理+熱洗+整燙和傳統工藝四種條件下的染色效果，主要指標有明亮度、紅綠度、黃藍度和彩度，結果見表2，可以看出，酶處理可以達到與傳統理同等的染色效果，因此，從本文的研究結果看，采用酶法工藝取代傳統過氧化氫去除工藝在紡織生產中是可行的。

更值得關注的是，采用酶法工藝取代傳統工藝，可以減少用水約二分之一，減少電耗約三分之一，在資源的節省和減少廢水排放方面有著明顯的優勢，因此，利用丁．皖銘m挖￡缸c淞WSH 03．01合成的CAT在紡織清潔生產中具有廣闊的應用前景。

3結論

在搖瓶水平下，以269／L的糊化玉米淀粉和1％乙醇(v／v)作為混合碳源與使用209／L的英國膠和1％乙醇(v／v)作為碳源相比酶活提高25％，達到了1996 u／mL，因此玉米淀粉完全可以替代英國膠作為T WSH 03—01工業化生產的碳源，而成本卻降低了70％以上。在發酵過程中添加乙醇除了可以作為碳源利用外，還有誘導產酶的作用。

溶解氧對T“WSH 03—01產酶有著重要的影響，除了要為菌體生長提供足夠的溶氧，

還需要保持一定水平的溶氧以誘導產酶。在7L發酵罐中采用分階段控制攪拌轉速以控制溶氧水平的策略可以較有效地解決發酵過程中。從過氧化氫去除效果實驗和整染清潔生產的實

際應用實驗可以看出，發酵生產的CAT對熱和堿對有著很高的穩定性，可以替代染整中傳統的過氧化氫去除工藝，而且在相同的染色效果下可以節約大量的水耗和電耗，減少了廢水處理的壓力。