類器官(Organoids)是將具有干性潛能的細胞在體外進行3D培養，形成多種特異性細胞類型集合的微器官團，能夠體外再現真實器官的三維構造及生理功能。然而體外培養的類器官往往缺乏有效的血管，隨著類器官體積的增加，缺氧及代謝廢物累積導致細胞凋亡，最終致使組織壞死，因此目前培養的類器官無論是形態大小還是生理功能都無法做到完全模擬真實的組織器官，這也是類器官培養技術發展的重大瓶頸之一。類器官的血管化研究一直是類器官研究領域的熱點與難點。本文中，我們整理了近年來科學家們在類器官血管化研究領域的進展，分享給大家。
01 腦類器官血管化研究
有研究表明中樞神經系統在發育過程中不會產生血管祖細胞[1]，血管祖細胞的缺乏則阻礙了類器官的血管化進程。為了培養血管化的腦類器官，2018年Pham
MT等[2]將同一患者來源的人誘導多能干細胞(iPSCs)衍生的血管內皮細胞(ECs)與腦類器官共培養，移植入免疫缺陷的小鼠腦內。移植當天免疫熒光檢測結果顯示CD31陽性細胞圍繞在類器官周圍，移植后隨著腦類器官在體內的進一步發育成熟，切片染色結果顯示新形成的人毛細血管強有力的向腦類器官干細胞核心區滲透，核心區外圍則顯示出典型的連續性內生化血管網絡結構。未血管化的腦類器官在移植后則無法存活，然而該研究尚未涉及移植物類器官血管與宿主血管之間的相互作用。
腦類器官染色圖，白色箭頭為新生血管[2] hCD31為血管細胞標志物；STEM121為人腦干細胞標志物；DAPI為細胞核染料。
2018年Mansour AA等[3]在體外將人胚胎干細胞(hESC)誘導分化為小型腦類器官后，直接移植入免疫缺陷小鼠軟腦膜血管上。移植的類器官繼續進行神經分化和成熟并與小鼠腦組織進行了很好的整合，雙光子掃描成像結果顯示小鼠血管侵入移植物并生長延伸，血管內血流活躍，移植物類器官功能性血管網絡發展良好。
小鼠腦內腦類器官血流圖[3]
人類ETS變體2(ETV2)轉錄因子與人血管內皮細胞的形成高度相關。2019年Cakir
B等[4]設計了一種表達人類ETV2轉錄因子的hESCs細胞，誘導該細胞分化成為帶血管蒂的人皮層腦類器官(vhCOs)。體外培養的vhCOs體積、神經細胞存活率均顯著大于對照組。在vhCOs中部分特殊的內皮細胞還形成了神經周血管叢，并與腦內的神經血管緊密相連，十分類似于血腦屏障結構。將該vhCOs移植入免疫缺陷的小鼠腿內，FITC灌注結果顯示ETV2誘導的內皮細胞支持功能性的血管系統形成。
2020年Shi
Y等[5]則是將hESCs或iPSCs與人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)共培養，定向誘導其分化為血管化的腦類器官。免疫熒光染色結果表明，HUVECs在腦類器官中相互連接，并形成具有通透能力的復雜血管系統，該血管系統可以在腦類器官中可穩定存在200天以上。研究者將血管化腦類器官植入免疫缺陷小鼠腦內S1皮質空洞中，免疫熒光檢測結果顯示在腦類器官移植物中HUVECs
與宿主小鼠血管內皮細胞發生了整合，并在腦類器官中形成了有血液流動的功能性血管網絡系統，支持其成熟存活。
02 肝類器官血管化研究
2011年Baptista PM等[6]使用灌注洗滌劑去除肝臟組織的細胞成分，同時保留了完整的的血管網絡。將hUVECs和人胎肝細胞(hFLCs)接種到脫細胞支架中，利用肝臟內部血管網絡包括大血管及微血管網絡結構，實現肝臟組織的血管化培養。
肝臟脫細胞后血管脈絡圖[6]
2013年Takebe
T等[7]將iPSC誘導形成的肝內胚層細胞與HUVECs和人骨髓來源的間充質干細胞(hBMSCs)共培養，待其形成具有三維球狀組織的肝芽(iPSC-LBs)，移植入免疫缺陷的小鼠中。移植48小時內免疫熒光檢測結果顯示移植的iPSC-LBs血管與宿主血管相互連接形成復雜的血管網絡，實時成像結果確認了宿主血液灌注到新形成的人體功能性血管網絡中。
03小腸類器官血管化研究
Holloway
EM等曾在小腸類器官的形成早期，檢測到大量的內源性血管內皮細胞，然而隨著培養時間的推移，血管內皮細胞(ECs)逐漸發生凋亡。2020年，他們在常規腸類器官培養方法的基礎上，在培養體系中加入EGF,
VEGF,
BFGF和BMP-4等細胞因子，誘導內源性ECs共分化，從而形成血管化的小腸類器官(vHIOs)[8]。體外培養數周后，免疫熒光法檢測結果顯示vHIOs間質內存在大量CD31/CD144雙陽ECs細胞，證實了內源性ECs的富集，ECs在培養體系中可長期存活2個月。
hPSC來源的小腸類器官(vHIO)及對照組染色圖[8] ECAD為蛋白染色；CD144為EC細胞標志物。
04腎臟類器官血管化研究
2019年Low
JH等[9]通過動態調節WNT信號通路，控制近端腎小球和遠端腎小管的比例，調節近端足細胞釋放血管內皮生長因子A(VEGFA)的水平，進而誘導血管化的腎臟類器官分化形成。免疫熒光檢測結果明確了腎臟發育的起始階段存在內源性血管內皮祖細胞，血管內皮祖細胞的發育依賴于足細胞分泌的VEGFA，并且VEGFA的分泌量決定了血管網絡的豐度。血管化的腎臟類器官移植入宿主小鼠后，繼續發育成腎小球毛細血管簇，右旋糖酐灌注實驗結果顯示與野生型小鼠腎臟類似，移植的腎臟類器官具有初步的過濾和重吸收功能。
第24天，腎類器官免疫熒光染色圖[9] CD34為ECs表面標志物; CD31為ECs表面標志物; NPHS為腎足突細胞標志物; DAPI為細胞核染料。
目前僅有少數種類的類器官血管化培養成功，該研究仍任重而道遠。誘導類器官血管形成的決定性因素尚不清楚。不同種類類器官血管化培養的條件也不盡相同。雖然血管化研究道阻且艱，但隨著研究者的不斷探索，或許在不久的將來，科學家們可以成功在體外構建具有血管可供移植的類器官，以造福人類。在科研的道路上迎難而上，終會破繭成蝶！
05相關細胞因子及小分子
PeproTech及旗下子公司BioGems為您提供類器官血管化研究用細胞因子及小分子。欲了解更多產品，歡迎撥打我們的服務熱線：40000-53055。
參考文獻
1. Bautch VL, et al. (2009) Neurovascular development: the beginning of a beautiful friendship. Cell Adh Migr. 3:199–204.
2. Pham MT, et al. (2018) Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport . 29(7):588-593.
3. Mansour AA, et al.(2018) An in vivo model of functional and
vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol . 36(5):432-441.
4. Cakir B, et al. (2019) Engineering of human brain organoids with a
functional vascular-like system. Nat Methods. 16(11):1169-1175
5. Shi Y, et al. (2020) Vascularized human cortical organoids
(vOrganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol.
18(5):e3000705.
6. Baptista PM, et al. (2011) The use of whole organ
decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.
Hepatology, ,53(2): 604-617
7. Takebe T, et al. (2013) Vascularized and Functional Human Liver
From an iPSC-derived Organ Bud Transplant. Nature. 499(7459):481-4.
8. Holloway EM, et al. (2020) Differentiation of human intestinal
organoids with endogenous 1 vascular endothelial cells. BioRxiv
angiogenesis in tissue-engineered intestine. Biomaterials. 29(19): 2884- 2890
9. Low JH, et al. (2019) Generation of human-PSC derived kidney
organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular
network . Cell Stem Cell. 25(3):373-387.e9.