適合HPLC餾分的一項先進的凍干技術（一）

簡介

干燥高效液相色譜（HPLC）純化餾分（主要成分為水和乙腈）是眾多實驗室中一項常見且重要的實驗任務。實驗的要求是將樣品干燥成粉末狀，以便準確稱量樣品、進行二次取樣或再次溶解。因此，冷凍干燥是實驗的首選技術，但是常規的大型冷凍干燥系統可能難以處理有機溶劑，因為有機溶劑很容易在樣品中暴沸，并因此損壞真空泵，造成樣品損失。Actelion Pharmaceuticals采用Genevac公司¹ 開發的快速凍干法（LyoSpeed?），使用Genevac HT-12離心蒸發儀來完成這項工作。LyoSpeed方法通過離心機來控制樣品的沸騰情況，使有機溶劑濃縮，并避免樣品損失，然后從冷凝器中抽出有機溶劑，使剩余的水份凍干。這種方法對于親水性樣品而言非常有效，但如果樣品不能溶于水，已經去除有機溶劑的樣品將會潰散，甚至會形成油脂狀。這些樣品則需要更進一步的處理才能形成所需的干粉狀態。

限制因素

標準化合物庫的平均操作成功率（完全凍干vs油性化合物）約為50％。根據化合物的不同屬性，最低和最高操作成功率可分別達到30％和90％。取得較高操作成功率的簡單方法，就是讓樣品凍干并使乙腈仍然保留在樣品中。遺憾的是，現有的設備還無法實現這樣的操作效果。

在硬件上也存在一定的限制因素，尤其是HT-12蒸發儀中溶劑冷凝器（VC3000）表現出的溫度特性。VC3000可以達到的最低溫度為-50°C，這就限制了蒸發系統可以達到的真空度。為了取得良好的凍干效果，真空度應盡可能低，最理想的狀態是能夠達到0.1mbar以下。例如，0.5mbar壓力條件下純凈水的沸點為-32℃，但乙腈在同等真空條件下的沸點可降至-61°C，因此會在煮沸時噴出冷阱和堵塞真空泵，導致蒸發系統中的壓力上升。壓力上升會提高溶劑的沸點，致使凍干效果不理想，甚至會導致凍干過程徹底失敗。使用LyoSpeed方法的目的不在于使樣品徹底凍干（如生產疫苗），而是要制出非油狀干燥粉末。正如真正的凍干過程一樣，只有實現更好的真空度，才能獲得更好的實驗結果。

開發出高級溶劑冷凝器

問題的解決辦法很明確，即實驗室需要更能制冷的冷凝器，以便在低真空度條件下使樣品濃縮并保留住乙腈成分。 研究人員與Genevac公司的工程設計團隊合作，通過連接至HT-12蒸發器的VirTis Benchtop K -85°C冷凍干燥機 (BTK)，對 VC3000 冷凝器進行了一系列的基準測試。工作團隊根據相應的實驗結果，開發出了命名為VC6000（圖1）的HT-12新型冷凝器。 VC6000的設計根據BTK的構造演變而來，具有更強的冷凝功效、可縮短除霜時間，且具有Genevac系統耐溶劑性。

圖 1 – 連接VC6000冷凝器的Genevac HT-12蒸發系統

材料與方法

進行測試的Genevac HT-12蒸發系統與VC3000，BTK或VC6000冷凝器相連。10ml樣品成分為水和乙腈混合物（體積比為50:50），制備樣品的容器為直徑16mm高度100mm的玻璃瓶，管壁厚度為1.2mm。堅實的PVDF塑料樣品架放置于HT-12蒸發器的翼側，并裝有24支玻璃試管。每支玻璃試管中的溶劑成分為： 非化合物，或20mg Diovan或市售的20mg其他化學物質，以及親脂性材料鄰苯二甲-β-丙氨酸（AI028492）。Diovan和AI028482都是較難從HPLC餾分中凍干的樣品，因此這樣的組合形成了“最難處理”的樣品。在兩種負載情況下測試每一款冷凝器。一種情況采用4架樣品（96支試管），另一種情況采用12架樣品（滿載288支試管）。

所有樣品和每一款冷凝器都采用相同的方法：

1.    利用Dri-Pure?真空坡道控制樣品沸騰/暴沸情況，操作時長為 1小時

2.    無熱全真空處理，操作時長為3小時

3.    在40°C溫度條件下對樣品架進行全真空熱處理，操作時長為4小時

4.    全真空無熱處理，操作時長為18小時

第4階段的處理時間很長，采用這種方法進行測試，實際的干燥時間可由記錄的數據圖表獲取。