遺傳發育所等聯合研究建立植物基因組引導編輯技術體系

　　基因組編輯技術可以定向修飾植物基因組，從而大大加速植物育種的進程，是實現作物精準育種的重要技術突破。然而，作物的許多重要農藝性狀是由基因組中的單個或少數核苷酸的改變或突變造成的。基于CRISPR/Cas系統的基因組編輯，可利用外源修復模板通過同源重組介導的修復方式（HDR）實現目標基因特定核苷酸的改變。目前，同源重組在植物中的效率非常低，很難以此方式實現高效、穩定的植物基因組的精準編輯。CRISPR系統所衍生的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，可以分別在基因組靶向位點實現C:G>T:A或A:T>G:C的堿基替換。然而，堿基編輯技術還不能實現其它類型的堿基替換(C:G>A:T和A:T>C:G)及堿基轉換(C:G>G:C和A:T>T:A)，更不能實現片段的精準插入和刪除。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要可以高效、精準實現任意堿基替換、增添或刪除的基因組定向編輯技術體系。

　　哈佛大學教授David R. Liu研究團隊在哺乳動物中開發了全新的基因組引導編輯（Prime Editing）系統。該系統由nCas9（H840A）融合逆轉錄酶（RT）和pegRNA（prime editing guide RNA)）兩部分組成。pegRNA通過在sgRNA骨架的3’端引入PBS序列（Primer binding site)結合到nCas9斷裂的非靶標鏈上，逆轉錄酶根據其攜帶的RT模板逆轉錄出相應的含有目的突變的單鏈DNA。細胞進一步通過DNA損傷修復把目的突變引入基因組。此外，在Cas9非靶標鏈上引入能在產生缺刻的nicking sgRNA，有助于提升引導編輯的效率。近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組與David R. Liu研究組合作成功建立并優化了適用于植物的引導編輯系統（Plant Prime Editing，PPE），并在重要農作物水稻和小麥基因組中實現精確的堿基替換、增添或刪除。

　　研究人員首先通過PPE系統在水稻和小麥原生質體中實現了16個內源位點的精準編輯，包括12種類型的單堿基替換、多堿基替換、小片段的精準插入和刪除，編輯效率最高可達19.2%。進一步研究發現，該系統的編輯效率受到PBS和/或RT模板長度以及nicking sgRNA位置的影響。研究人員對PPE系統進行了一系列的優化，發現37℃條件下培養可以顯著提升該系統的編輯效率(1.6倍)，通過引入核酶對pegRNA進行自加工，也可以在部分位點提高編輯效率。此外，來源于植物花椰菜花葉病毒和大腸桿菌retron系統的逆轉錄酶可以與nCas9融合在植物中實現精準引導編輯。最后，研究人員通過PPE成功獲得了單堿基突變、多堿基突變及精準刪除的水稻突變體植株，效率最高可達21.8%，這些突變均難以通過現有的基因編輯系統實現。雖然Plant Prime Editing系統在部分位點上C:G>T:A或A:T>G:C的效率低于單堿基編輯系統，但是該系統可以實現所有類型的堿基置換，以及堿基增加和刪除。PPE極大地擴展了植物基因組編輯范疇，為植物基因組功能解析及實現作物精準育種提供了重要技術支撐。

　　研究成果于3月16日在線發表于Nature Biotechnology 雜志（DOI:10.1038/s41587-020-0455-x）。遺傳發育所高彩霞研究組博士生林秋鵬、博士后宗媛以及博士生薛郴銷為該論文的共同第一作者，高彩霞為論文的通訊作者。高彩霞研究組的研究得到國家自然科學基金、中科院戰略性先導科技專項、國家重點研發計劃的資助。

圖: 植物基因組引導編輯系統（PPE）可精準編輯植物基因組。(a) PPE編輯系統工作原理示意圖。(b) 熒光報告系統比較不同PPE編輯系統工作效率。(c) PPE編輯系統可在多個內源位點上產生12種類型的單堿基變換，以及多堿基變換和小片段增刪。