酵母的高效轉化
1.接種5ml液體YPAD或10ml SC,30℃下振蕩培養過夜。
2.計數過夜培養物細胞密度,以最終5×106個/ml的細胞密度接種50ml YPAD培養液。
3.置30℃,200r/min振蕩培養至2×107個細胞/ml,通常需要3~5小時,該培養物的細胞足夠供十次轉化用。
4.用50ml無菌離心管以3000g(2500r/min)離心5分鐘,收獲細胞。
5.棄培養液,把細胞懸浮在25ml無菌水中,再同上離心。
6.棄水,把細胞懸浮在1ml的100mmol/L醋酸鋰中,轉懸浮物到一個無菌1.5ml離心管。
7.高速離心5秒鐘沉淀細胞,用微量移液器吸出醋酸鋰。
8.懸浮細胞到最終500μl體積其中大約含400μl的100mmol/L醋酸鋰。
9.將1ml單鏈載體DNA樣品煮沸5分鐘,快速在冰水中冷卻。
10. 振蕩細胞懸浮液,取50μl樣品加到標記的離心管中,離心沉淀細胞,用微量取樣器除去醋酸鋰。
11. 基本“轉化混合液”由下列成分組成,小心按下列順序如下:
240μl PEG(50% w/v)
36μl 1.0mol/L 醋酸鋰
25μl 單鏈載體DNA(2.0mg/ml)
50μl 水和質粒DNA(0.1~10μg)
12. 劇烈振蕩每個反應管每個反應管直到細胞完全混勻,通常需要1分鐘左右。
13. 置30℃保溫30分鐘。
14. 置42℃水浴中熱激20~25分鐘。
15. 以6000~8000r/min離心15秒,用微量移液器除去轉化混合液。
16. 吸0.2~1.0ml無菌水加到每個反應管中,用移液器上下輕輕抽提以懸浮沉淀。
17. 用等份的200μl轉化混合液涂選擇平板。