酶聯免疫吸附測定黃曲霉毒素B1

(1)分析原理  

將已知抗原吸附在固態載體表面,洗除未吸附抗原,加入一定量抗體與待測樣品(含有抗原)提取液的混合液,競爭培養后,在固相載體表面形成抗原抗體復合物。洗除多余抗體成分,然后加入酶標記的抗球蛋白的第二抗體結合物,與吸附在固體表面的抗原抗體復合物相結合,再加入酶的底物。在酶的催化作用下,底物發生降解反應,產生有色物質,通過酶標檢測儀測出酶底物的降解量,從而推知被測樣品中的抗原量。

(2)試劑與儀器  

四甲基聯苯胺(TMB),30%過氧化氫,牛血清白蛋白,吐溫-20等抗體:抗黃曲霉毒素B₁ 的特異性單克隆抗體(或抗血清)。

包被抗原:黃曲霉毒素 B₁ 與載體蛋白(牛血清白蛋白或多聚賴氨酸等)的結合物。

酶標二抗:羊抗鼠免疫球蛋白 G 與辣根過氧化酶結合物。

緩沖液系統:包被緩沖液為 PH9.6的磷酸鹽緩沖液;洗液為含0.05%吐溫-20的PH7.4的磷酸鹽緩沖液;底物緩沖液為 PH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液;終止液為1mol/L的硫酸。

黃曲霉毒素 B₁ 的標準溶液:用甲醇配成1mg/mL 的黃曲霉毒素 B₁ 貯備液,-20℃冰箱貯存,于檢測當天,準確吸取貯備液,用20%甲醇的 PBS 稀釋成制備標準曲線的所需濃度。

(3)測定步驟

①提取:稱取10g 粉碎的樣品于錐形瓶中,用50mL 乙腈-水(50+50,V/V),用2mol/L碳酸鹽緩沖液調 pH 值至8.0進行提取,振搖30min 后,濾紙過濾,濾液用含0.1%BSA的洗液稀釋后,供 ELISA 檢測之用。

②用包被抗原(包被緩沖液稀釋至10μg/mL)包被酶標微孔板,每孔100μL。4℃過夜。

③酶標微孔板用洗液洗3次,每次3min 后,每孔加50μL 系列標準黃曲霉毒素 B₁ 溶液(制作標準曲線)或50L 樣品提取液(檢測樣品),然后再加入50μL 稀釋抗體,37℃培養1.5h。

④酶標微孔板用洗液洗3次,每次3min 后,每孔加100μL 酶標二抗。37℃培養2h。

⑤酶標微孔板用上法洗后,每孔加100μL底物溶液(配制方法:10mg 四甲基聯苯胺溶于1mL 二甲基甲酰胺中,取7L 四甲基聯苯胺溶液,加入10mL 底物緩沖液,加10μL 30%過氧化氫溶液),37℃培養30min 后,用1mol/L 硫酸中止反應。

⑥計算:

黃曲霉毒素 B₁ 濃度(ng/g)=C×V₁/V₂×D×1/m

式中C——酶標微孔板上所測得的黃曲霉毒素 B₁ 的量,ng,根據標準曲線求得;

V₁——樣品提取液的體積,mL;

V₂——滴加樣液的體積,mL;

D——樣液的總稀釋倍數;

m——樣品質量,g。

檢測靈敏度:0.1～1ng/mL。