長距離PCR

DNA 模板正向引物

氯仿dNTP 貯存液長距離 PCR 緩沖液熱穩定 DNA 聚合酶混合液

瓊脂糖凝膠屏蔽型槍頭離心管正向排液式移液器PCR 儀

一、材料

1. 緩沖液與溶液

氯仿

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

10X 長距離 PCR 緩沖液（500 mmol/L Tris-Cl ( pH 9.0，室溫），160 mmol/L 硫酸銨，25 mmol/L MgCl₂，1.5 mg/ml 牛血清白蛋白）

2. 酶與緩沖液

熱穩定 DNA 聚合酶混合液

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠

4. 核苷酸與寡核苷酸

DNA 模板

正向引物（20 μmol/L) 與反向引物（20 μmol/L）溶于水

5. 特殊設備

自動微量移液器的屏蔽型槍頭

離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專用離心管）

正向排液式移液器

PCR 儀

二、方法

1. 用一只薄壁擴增離心管，依次加入如下試劑，混合：

10X 長距離 PCR 擴增緩沖液            5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液           5 μl

20 mmol/L 正向引物                       1 μl

20 mmol/L 反向引物                       1 μl

熱穩定 DNA 聚合酶混合液               0.2 μl

DNA 模板                                      100 pg~2 μg

H₂O 補足至                                    50 μl

2. 如果 PCR 僅沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴透明的礦物油（約 50 μl）；若應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一層石蠟油。放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。按以下方法進行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合 (延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：



3. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟 2)，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

4. 抽取擴增產物水相的若干樣品，用瓊脂糖凝膠電泳再輔以適當大小的 DNA marker 來分析擴增結果。在許多情況下，擴增產物太少以致于用常規的溴化乙錠染色不能檢測到目的條帶。在這種情況下，用 SYBR 金顆粒對凝膠上的 DNA 樣品進行染色或轉移凝膠上的 DNA 樣品到尼龍或硝酸纖維素濾膜上用探針進行 Southern 雜交予以確證。