根據酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子，限制性內切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ酶。最早從大腸桿菌中發現的EcoK、EcoB就屬于I類酶。其分子量較大；反應過程中除需Mg2+外，還需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷，這是I、Ⅱ類酶之間最明顯的差異。因此，I類酶作為DNA的分析工具價值不大。Ⅱ類酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道爾頓；反應只需Mg2+；最重要的是在所識別的特定堿基順序上有特異性的切點，因而DNA分子經過Ⅱ類酶作用后，可產生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑒別。
限制性內切酶識別DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位點在回文的一側（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ類酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位點在回文序列中間，形成平整末端。Alu I的切割位點如下：
5'-A G^C T-3'
3'-T C^G A-5'
在已發現的限制性內切酶中，近百種酶的識別順序已被測定。有很多來源不同的酶有相同的堿基識別順序，這種酶稱為“異源同功酶”（isochizomer，同切限制內切酶；同裂酶）。應該注意的是，這些酶雖然有相同的識別順序，但它們的切點并不完全一樣。例如Xma I和Sma I都識別六核苷酸CCCGGG，但Xma I的切點在CCCCGGG，而Ema I的切點則在CCCGGGG，前者切割DNA分子，形成帶有CCGG粘性末端的DNA片段，而后者并不形成粘性末端（而叫平末端）。當然，也有識別順序和切點都相同的酶，如Hap Ⅱ、Hpa Ⅱ、Mno I，都在識別順序CCGG內有一相同的切點，Hal Ⅲ和BsuR I同樣在識別順序GGCC內有一相同的切點。