靶向序列捕獲和新一代測序前對石蠟包埋組織及...（二）

捕獲前擴增

四個 DNA 樣品按照樣品前處理工作流程（圖 1）進行進一步處理。對捕獲前擴增樣品進行五次 PCR 循環，然后采用 DNA 1000 試劑盒在 2100 生物分析儀上進行分析（圖 3）。
 

圖3. 使用 Agilent 2100 生物分析儀及安捷倫 DNA 1000 試劑盒分析所得的捕獲前擴增樣品的電泳疊加譜圖。樣品：FFPE DNA Q（紅色），FFPE DNA A（藍色），新鮮冷凍組織 DNA（綠色），對照 DNA（淺綠色）

所有 DNA 樣品的譜圖在大約 100 至 900 堿基之間十分類似。平均分子量為 307 至 348 堿基之間，最大峰高位于 254 至 271 堿基之間（表 1）。未觀察到任何擴增假體或引物二聚體。此外，2100 生物分析儀可自動提供彌散條帶的 DNA 濃度，其介于 23 至 90 ng/μL 之間。

表 1 捕獲前擴增文庫的平均分子量、峰高及定量

捕獲后擴增

SureSelect 實驗方案中的最后一個 DNA QC 步驟需要對捕獲后樣品進行 10 次循環擴增，然后采用高靈敏度 DNA 試劑盒在 2100 生物分析儀上進行分析（圖 4）。觀察結果表明，所有四個樣品的電泳譜圖較為一致，彌散條帶從 225 至 600 堿基，峰高為 314 至 336 堿基（表 2）。分子量分布及 DNA 文庫的產量均在 Illumina 末端配對多重測序所推薦的范圍之內（2 × 76 bp 讀長）。
 

圖4. 使用 Agilent 2100 生物分析儀系統及高靈敏度 DNA 試劑盒分析所得的捕獲后擴增文庫的電泳疊加譜圖。樣品：FFPE DNA Q（紅色），FFPE DNA A（藍色），新鮮冷凍組織 DNA（綠色），對照 DNA（淺綠色）

表 2 捕獲后擴增文庫的平均分子量、峰高及定量

結論

在 SureSelect 靶向序列捕獲的樣品前處理工作流程中，2100 生物分析儀被應用于 FFPE 樣品的 NGS 樣品 QC。可靠的 DNA 芯片電泳可提供彌散條帶譜和詳細的文庫統計信息，例如峰高、平均彌散條帶分子量、分子量分布和 DNA 濃度。FFPE、相匹配的新鮮冷凍組織，以及對照細胞系 DNA 所得結果適用于下游的Illumina 平臺測序。

參考文獻
 
1. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., and Bouzyk, M. M., “DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue”, Cold Spring Harbor Protocols, doi:10.1101/pdb.prot5138, 2009.
2. Kirill Gromadski, Rüdiger Salowsky, Susanne Glück, “Improving sample quality for SureSelect target enrichment and next-generation sequencing with the Agilent High Sensitivity DNA kit”（采用安捷倫高靈敏度 DNA 試劑盒提高SureSelect 靶向序列捕獲及新一代測序的樣品質量），安捷倫科技應用簡報，出版號 5990-5008EN，2010
3. “SureSelect Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing”
（適用于 Illumina 末端配對測序的
SureSelect 靶向序列捕獲系統），安捷倫科技操作手冊，出版號 G7530-90000， 2012
4. “Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide”
（安捷倫高靈敏度 DNA 試劑盒指南），安捷倫科技操作手冊，出版號 G2938-90321， 2009
5. “Agilent DNA 1000 Kit Guide”（安捷倫DNA 1000 試劑盒指南），安捷倫科技操作手冊，出版號 G2938-90014，2006