【摘要】 目的：建立氫氯噻嗪原料藥的含量測定方法。方法：采用C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1 mol/L磷酸二氫鈉?乙腈（9∶1）（用磷酸調節pH值至3.0）為流動相，檢測波長271 nm，流速1.5 mL/min，柱溫30 ℃。結果：氫氯噻嗪濃度在0.004～0.20 mg/mL濃度范圍內與峰面積線性關系良好（r=0.9999，n=7），加樣回收率99.82%，RSD=0.98%。結論：該方法專屬性強，靈敏度高，重復性好，操作簡便，適用于氫氯噻嗪原料的質量控制。
【關鍵詞】 氫氯噻嗪 高效液相色譜法 含量測定
HPLC Determination of Hydrochlorothiazide
ZENG Tan, ZHOU Lin
(Chongqing Institute for Drug Control, Chongqing 400121, China)
［Abstract］ Objective:To develop an HPLC method for the determination of Hydrochlorothiazide. Methods: The chromatographic separation was performed on a C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) held in the oven of 30 ℃. The mobile phase consisted of a degassed mixture of 0.1 mol/L monobasic sodium phosphate and acetonitrile (9:1), adjusted with phosphoric acid to a pH of 3.0. The flow rate was 1.5 mL/min and UV detection wavelength was 271 nm. Results: The calibration of the responses of hydrochlorothiazide ranged from 0.004 to 0.20 mg/mL with a correlation coefficient of 0.9999, recovery rate of 99.82% and RSD=0.98%. Conclusions: The method proves to be quick, simple and sensitive. It could be applied into the quality control of hydrochlorothiazide.
［Key words］ Hydrochlorothiazide; High performance liquid chromatography; Determination of content
氫氯噻嗪是一種臨床應用十分普遍的藥物，主要抑制髓袢升支皮質部對Na+和Cl?的重吸收，使腎臟對氯化鈉的排泄增加而產生利尿作用，常與其他降壓藥物配合作用治療高血壓。原質量標準采用甲醇鈉滴定法測定其含量［1］，毒性較大且操作不便，方法精密度差。本研究參考國內外氫氯噻嗪原料的質量標準［2］，建立了氫氯噻嗪含量測定的HPLC方法。
1 儀器和試藥
Agilent 1100高效液相色譜儀（配有紫外檢測器及二極管陣列檢測器），AE240型電子天平（瑞士梅特勒）。磷酸二氫鈉（分析純，重慶北碚化學試劑廠）、乙腈（色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司）、水（二次蒸餾水）、氫氯噻嗪對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為100309?200702，含量99.8%）。
2 方法與結果
2.1 測定波長選擇
取氫氯噻嗪對照品20 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇?乙腈（1∶1）5 mL溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 mL置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，在200～400 nm波長處掃描，掃描結果見圖1。由圖可見，最大吸收波長為224 nm、271 nm。224 nm波長靠近末端吸收且雜質在此波長處吸收較大，故選擇271 nm做為檢測波長。
圖1 氫氯噻嗪紫外掃描圖譜（略）
2.2 色譜條件及系統適用性實驗
色譜柱：pHenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液?乙腈（9∶1）（用磷酸調節pH值至3.0）；測定波長：271 nm；流速：1.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，氫氯噻嗪峰的保留時間為11.217 min，理論塔板數為19 054，氫氯噻嗪峰與最近雜質峰的分離度為13.58。色譜圖見圖2。
圖2 氫氯噻嗪原料色譜圖（略）
2.3 線性范圍
精密稱取氫氯噻嗪對照品20.00 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇?乙腈（1∶1）5 mL溶解并用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別量取對照品儲備液適量，用流動相稀釋制成每毫升含0.004、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.20 mg的溶液。照上述色譜條件，分別各取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度為x，峰面積為y，計算回歸方程為：y=1.5553+24769.1x，r=0.9999（n=7），表明氫氯噻嗪在0.004～0.20 mg/mL濃度范圍內與峰面積的線性關系良好。
2.4 檢測限與定量限
取濃度為0.1004 μg/mL的氫氯噻嗪對照品溶液進樣10 μL，氫氯噻嗪峰的信噪比為3.7。以S/N為3和10分別計算氫氯噻嗪的檢測限和定量限，分別為0.0814 μg、0.269 μg。
2.5 專屬性試驗
稱取氫氯噻嗪約20 mg，分別經高溫破壞（置坩鍋中，電爐上加熱至供試品熔融變色）、酸破壞（加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL，置水浴中煮沸1 h，放冷，調節pH值至中性）、堿破壞（加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，置水浴中煮沸1 h，放冷，調節pH值至中性）、氧化破壞（加36%過氧化氫溶液5 mL，室溫放置1 h）、光照破壞（1 500 lx光照48 h）后，再分別加甲醇?乙腈（1∶1）5 mL溶解，加流動相稀釋至50 mL，搖勻，過濾，精密量取續濾液5 mL置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。取上述破壞后的樣品溶液，照上述色譜條件分析，記錄色譜圖。色譜圖見圖3。
圖3 專屬性試驗色譜圖（略）
從上述圖譜可以看出，本品經破壞后產生的降解產物均能與氫氯噻嗪主峰有效分離，用二極管陣列檢測器在210 nm至400 nm的范圍內掃描，氫氯噻嗪主峰的峰純度均在990以上。說明上述條件可用于測定氫氯噻嗪的含量。
2.6 精密度試驗
取“2.3”項下濃度為0.04 mg/mL的溶液，照上述色譜條件進行分析，連續進樣5次，記錄色譜圖。峰面積的RSD為0.05%。
2.7 系統耐用性
分別用Agilent公司、pHenomenex公司、Aichrom公司的色譜柱按上述條件試驗，不同公司的色譜柱對檢測影響不大，結果基本一致。說明本方法的耐用性較好。
2.8 重復性試驗
精密稱取氫氯噻嗪原料共6份，各約20 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇?乙腈（1∶1）5 mL溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 mL置50 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。氫氯噻嗪對照品同法配制作為對照品溶液。按上述色譜條件分析，記錄色譜圖。計算氫氯噻嗪原料含量平均值為99.32%，RSD為1.23%。
2.9 回收率試驗
精密稱取氫氯噻嗪樣品和對照品各20.00 mg，濃度均精密定容為0.04 mg/mL，各取10 mL樣品溶液，分別精密加入80%、100%、120%（以體積計）的對照品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，以外標法定量，計算回收率，結果見表1。
表1 加樣回收率試驗結果（略）
3 討論
氫氯噻嗪原料藥的現行質量標準為《中國藥典》2005年版二部，含量測定項采用非水滴定法，專屬性不強，氫氯噻嗪的合成中間體及水解產物4?氨基?6?氯?1,3?苯二磺酰胺會消耗滴定液，此外甲醇鈉滴定液毒性較大且濃度不穩定，在實際工作中既不環保也不方便操作。采用高效液相色譜法測定，方法簡便可行。氫氯噻嗪合成中間體及水解產物4?氨基?6?氯?1,3?苯二磺酰胺和氫氯噻嗪主峰分離度較好，減少了該雜質對含量測定的影響。以流動相配制的溶液，在12 h內穩定。該方法專屬性強，靈敏度高，重復性好，操作簡便，適用于氫氯噻嗪原料的質量控制。
【參考文獻】
［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（二部）［S］. 北京: 化學工業出版社, 2005: 406.
［2］ 美國藥典委員會. 美國藥典［S］. 第27版. 2004: 918.