高效液相色譜法測定熱毒平顆粒中綠原酸的含量

【摘要】 目的 建立以高效液相色譜法測定熱毒平顆粒中綠原酸含量的方法。方法 色譜柱為YMC公司ODS-A柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液(10∶90),流速為1.0 mL/min,檢測波長為327 nm。結果 綠原酸的檢測濃度在0.084 8～0.848 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系(r=0.999 9);平均回收率為102.60%,RSD=1.69%(n=6)。結論 本法簡便、快速,可用于熱毒平顆粒的質量控制。

【關鍵詞】 熱毒平顆粒;綠原酸;高效液相色譜法;含量測定

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the determination of Chlorogenic acid in Reduping Keli. Methods The determination was performed by HPLC using an YMC ODS-A column (150 mm×4.6 mm, 5 μm), with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%H3PO4 solution (10∶90) at a flow rate of 1.0 mL/min and a detection wavelength of 327 nm. Results The calibration curve for Chlorogenic acid was linear in the concentration range of 0.008 5～0.084 8 mg/mL (r=0.999 9). The average recovery was 102.60 % (RSD=1.69%, n=6). Conclusion The method is simple, rapid and applicable for the quality control of Reduping Keli.

Key words：Reduping Keli;Chlorogenic acid;HPLC;content determination

熱毒平顆粒由金銀花、生石膏、玄參、地黃等中藥制成,具有清熱解毒之功效,用于治療流感、上呼吸道感染及各種發熱等癥[1]。綠原酸為該制劑主藥金銀花的主要有效成分,具有明顯的抗炎、殺菌、抗病毒的作用[2]。筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定該制劑中綠原酸的含量,方法簡便、快速,可用于熱毒平顆粒的質量控制。

1 儀器與試藥

SP8800高效液相色譜儀(美國光譜物理公司);分析之星色譜工作站;紫外FOCUS檢測器。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110753-200413);熱毒平顆粒(天津中新藥業隆順榕制藥廠,批號0602001、0602002、0602003)。乙腈為色譜純,磷酸為分析純,水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性試驗

色譜柱：YMC公司ODS-A柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液(10∶90);流速：1.0 mL/min;柱溫：室溫;檢測波長：327 nm;進樣量：10 μL。理論板數按綠原酸峰計應不低于3 000,分離度>1.5。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品4.24 mg,置于50 mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,配成濃度為0.084 8 mg/mL的對照品儲備溶液,10 ℃以下保存。再精密量取4 mL置10 mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀釋至刻度,制成含綠原酸0.033 9 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品7 g,精密稱定,研細,混勻,取約0.5 g,精密稱定,放入具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,稱定重量,密塞,超聲處理(功率250 W,頻率33 kHz) 30 min,放冷,再稱定重量,用50 %甲醇補足減失的重量,搖勻,以0.45 μm微孔濾膜濾過,取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備

按處方取除金銀花的各味藥材,按制法制得樣品,再按“2.2.2”項下方法,制得陰性對照溶液。

2.3 標準曲線的建立

精密吸取綠原酸濃度為0.084 8 mg/mL的對照品儲備溶液1、2、4、8、10 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,在上述色譜條件下測定,以峰面積對濃度進行線性回歸,得回歸方程為：Y=55 799 416X-28 478.3(r=0.999 9)。結果表明,綠原酸檢測濃度在0.084 8～0.848 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL,按上述色譜條件重復進樣6次,測定峰面積。結果RSD=0.52%,表明本方法精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取同一批號(0602001)樣品,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件分別在0、1、2、4、6、8 h進樣,測定綠原酸峰面積。結果RSD=0.64%,表明供試品溶液在8 h之內穩定。

2.6 重復性試驗

取同一批號(0602001)樣品精密稱取0.5 g,共6份,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定每份樣品中綠原酸含量。結果綠原酸的平均含量為1.190 mg/g, RSD=0.88%,表明方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取綠原酸對照品適量,配制成0.012 4 mg/mL的對照品儲備溶液,取同一批號(0602001)樣品,研細,混勻,取0.25 g,精密稱定,共6份,精密加入綠原酸對照品儲備溶液各25 mL,按照“2.2.2”項下方法制得供回收率用供試品溶液,按上述色譜條件測定,計算回收率。結果平均回收率為102.60%, RSD=1.69%。結果見表1。表1 加樣回收率試驗結果(略)

2.8 樣品含量測定

取本品3批,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件進行測定,結果見表2。表2 樣品中綠原酸含量測定結果(略)

3 討論

取綠原酸對照品的甲醇溶液,在190～650 nm波長范圍進行掃描,在327 nm波長處有較大吸收,與2005年版《中華人民共和國藥典》中金銀花的測定波長一致,故測定波長選定為327 nm。

以多種比例乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85、13∶87、10∶90)試驗選擇流動相[3-5],當比例為10∶90時,綠原酸峰分離度大于1.5,保留時間為6.967 min,主峰與雜質峰分離良好,同時無干擾峰,基線平直。

【參考文獻】

[1] WS3-B-3965-98,中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第22冊)[S].

[2] 畢躍峰,田 野,裴姍姍,等.金銀花中裂環環烯醚萜苷類化學成分研究[J].中草藥,2008,39(1)：18-21.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學工業出版社,2005.153.

[4] 劉 冰,王蓉華,徐永波.HPLC法同時測定銀黃膠囊中綠原酸、黃芩苷含量[J].中國藥事,2006,20(5)：303.

[5] 孟品佳,孫毓慶.高效液相色譜法分離金銀花成份及測定綠原酸含量[J].藥物分析雜志,1990,10(1)：58.