邊合成邊測序：SNA（454，Ion Torrent）
與CRT不同的是，SNA方法依賴于單信號標記dNTP來對鏈進行延伸。四種核糖核酸都必須反復添加到測序反應過程中。不僅如此，SNA不需要將dNTP屏蔽，因為測序反應過程中下一個堿基的缺失會阻止鏈的延伸。堿基的寡聚體則是一個例外，在這種情況下，信號的強度會隨著dNTP數量的增加而成比例的增強。
第一個NGS儀器是454焦磷酸測序儀24。這種SNA系統將結合有模板的珠子以及酶混合物分配到PicoTiterPlate中。由于一個dNTP只能結合到一條鏈上，酶復合物會對其產生生物熒光。一個特定的珠子中的一個或多個dNTPs可以通過電荷共軛偶聯設備（charge-coupled
device, CCD）檢測到的熒光來確認（圖4a）。
Ion
Torrent是第一個沒有光學感應的NGS平臺25。與酶化學復合物產生的信號相比，Ion
Torrent平臺檢測的是dNTP中釋放出來的H離子。pH值的改變通過（integrated complementary
metal-oxide-semiconductor，CMOS）以及（ion-sensitive field-effect
transistor，ISFET）來檢測（圖4b）。傳感器對pH的變化對于連續堿基的檢測還不夠完善，因此在測量同一堿基連續出現時的數量可能會有所誤差。
圖4: 邊合成邊測序：單核糖核酸添加法。
短讀長平臺的比較
每個平臺在通量，成本，錯誤率以及read結構上都大相徑庭（表一）。盡管有多家NGS技術供應商，NGS研究最常用的還是Illumina平臺21。盡管該平臺極為穩定，數據可靠，但是基于其使用的單一測序的方法26-28，既然具有系統偏好性的問題。因此，新技術的發展使得研究人員能夠有完整的測序方案來獲得完整的序列信息。
SOLiD與Complete
Genomics系統使用的SBL技術準確率非常高（~99.999%）7,14,因為每個堿基都會被標記多次。雖然這些技術非常準確，但是在敏感性與特異性之間依然不能達到完美的平衡，當一些錯誤的堿基變化出現時，真實的堿基變化可能被忽略29-31。該類技術在應用上最大的限制可能就是其過短的讀長。盡管所有的平臺都能產生單末端和雙末端的reads，SOLiD的最大讀長只能達到75bp，Complete
Genomics只能達到28-100bp33，使得其在基因組拼接和結構變異研究中的可操作性大大降低。不幸的是，SOLiD系統不僅受制于運行時間，還受制于其工業生產。另外，盡管cPAL計劃準備在成本和通量上和Illumina競爭，卻在2016年被迫下馬，該技術僅在人類WGS中有所應用33,34。cPAS的BGISEQ-500系統則受制于中國大陸政府。
Illumina由于其技術成熟，平臺之間高度互補性與交叉性，使得其在短讀長測序上大占優勢。Illumina的產品覆蓋了從低通量的Mini-Seq到超高通量的HiSeq
X系列，其中HiSeq
X系列最多可以在一年內產生1800多個30×覆蓋度的人類基因組數據量。此外，其運行時間，read結構以及read長度（最大300bp）都在不停的改進。但是，作為一個依賴于CRT技術的Illumina平臺，相對于SNA平臺的優勢在于其在讀取核糖核酸多聚體（同一種核糖核酸多次出現）時較低的錯誤率。盡管SNA平臺總體上的準確率可以達到99.5%35，但是在讀取那些高AT富集或者高GC富集的片段的時候錯誤率差強人意32,37,38。在2008年，據Bentley等報道，Illumina平臺鑒定到的人類單核糖核酸多態性（SNPs）與基因芯片鑒定的SNPs具有驚人的一致性35。但是，這種高度的敏感性也隨之帶來了2.5%左右的錯誤率。因此，其他小組計劃使用Sanger測序來對鑒定到的SNPs進行重新測序以便區分測序錯誤導致的SNPs與真實的基因突變導致的
SNPs35,39,40。在對所有的可能性都進行優化之后，Illumina平臺被大量的研究人員認可，在大量的領域中均有涉及：WGS的基因組測序與外顯子測序；遺傳學應用如染色質免疫共沉淀——測序（chromatin
immunoprecipitation followed by
sequencing）41；ATAC-Seq（transposase-accessible chromatin using
sequencing）42或者DNA甲基化測序（Methyl-Seq）43；RNA轉錄組測序（transcriptomics
applications through RNA sequencing,
RNA-seq）44等等。NextSeq與MiniDeq平臺使用的雙色標記系統通過降低雙色通道的掃描與熒光基團的使用達到成本并且增加測序速度。然而，雙通道系統卻會略微增加測序的錯誤率45。HiSeq
X是目前最高通量的儀器，但其由于通量過大，因此只在部分應用上得以使用，如WGS與全基因組甲基化測序。不僅如此，HiSeq
X更大的局限在于其高昂的成本，以至于超過了絕大多數單位的可接受程度。
Qiagen的GeneReader是專為臨床診斷設計的，其主要關注點在腫瘤基因panels46上，也因此其局限性較大。根據對其運行時間與功能的分析，GeneReader與Illumina的MiSeq較為相似46。盡管還沒有使用數據，但是GeneReader和MiSeq平臺有相同的優缺點。
454平臺和Ion
Torrent平臺相比于其他的短讀長平臺而言，能夠提供較長的read讀長，分別大約在700bp與400bp，因此在基因組結構較為復雜的研究上應用較多。然而，由于同樣都是基于SNA技術，它們都擁有相同的缺點。雖然，其在非堿基多聚體（non-homopolymer）的測序上正確率與其它NGS平臺相差無幾，但其插入與缺失（Insertion
and
deletion，indel）是最大的問題。同一堿基的多聚體是該類技術最大的問題所在。有報道，對同一堿基的多聚體的測序誤差能夠達到6-8個堿基之多47,48。不幸的是，盡管Ion
Torrent依然在緊跟快速進化的NGS平臺的步伐，454平臺卻由于成本與應用范圍過于狹小卻已經被羅氏公司停產。
Ion
Torrent平臺為不同的研究人員的不同需求提供了不同的芯片與設備，通量從50Mb到15Gb不等，運行時間也從2小時到7小時不等。這一點使得其幾乎是所有目前的二代測序平臺中最快的一個。這也使得其在基因panel與精準臨床診斷上大有優勢50，包括轉錄組與可變剪切鑒定51。Ion
Torrent先后發布Ion Personal Genome Machine （PGM） Dx與Ion
S5系列希望于在臨床診斷上打開疆土。與Ion Chef文庫制備試劑盒和芯片上樣設備結合使用，S5系列希望能夠成為最方便操作的設備，消除其它Ion
Torrent設備對氬的依賴。但是，其最大的缺點在于Ion PGM Dx系統可以進行雙向測序，更高通量的Ion
Proton與S5系統卻并不支持雙向測序，也因此限制了其在大范圍基因組測序與轉錄組結構上的應用。
長讀長（read）的NGS測序
綜述
基因組是一個復雜的復合物，其中包含了多種重復序列，拷貝數變化，結構變異。這些與進化，適應以及疾病密切相關54-56。然而，許多復合物元件由于過長，導致短讀長測序并不能夠完美的對其進行測序。長讀長測序的reads可以達到幾千個堿基，這使得可以對大的結構進行功能解析。此類的長讀長測序產生的單一長序列可以跨越復合物或者重復序列。長讀長測序在轉錄組測序過程中也大有益處，因為長讀長的reads可以跨越完整的mRNA的轉錄本而不需要拼接。這可以使得研究人員可以鑒定到更多的基因亞型等。
最近，人們開發出了兩種長讀長測序的實驗方案，分別是：單分子實時測序（single-molecule
real-time sequencing
）以及依賴于已有短讀長技術體外構建長讀長的合成法。單分子法與短讀長測序完全不同，因為單分子法不需要對模板進行擴增來產生足夠測序儀讀取的信號，也不需要輪番添加dNTP。而合成法并非產生原始的長讀長的reads，而是通過利用barcodes來進行拼接獲得長片段。