利用2D-LC/MS/MS分析藥代動力學研究中的藥物及其代謝物。本文展示將 Agilent InfinityLab 二維液相色譜解決方案與 Agilent 6495 三重四極桿液質聯用系統結合使用，分析藥代動力學研究中的藥物及其代謝物。二維液相色譜可避免出現共洗脫，因此能夠減少信號抑制以及交叉干擾風險，這些問題可能存在于復雜樣品的一維分析中。通過以更適合的洗脫方式將分析物引入質譜離子源，2D-LC/MS/MS 分析方法的第二維可用于提高質譜檢測的信號強度。
過去十年間，LC/MS/MS 已成為了藥代動力學研究中用于分析藥物及其代謝物的一項成熟技術。這項技術除高選擇性、高分析靈敏度以及在峰歸屬或分子量信息等方面具有明顯優勢以外，也遇到了一些眾所周知的困難，如難以對血漿或細胞培養基等基質復雜的生物樣品進行分析。信號抑制的問題在低濃度分析物定量時尤為突出，可能造成定量限不達標。就如何將 Agilent InfinityLab 二維液相色譜解決方案與 Agilent 6495 三重四極桿液質聯用系統結合在生物分析研究環境中克服上述難題，本文詳細列舉了兩個示例，分別是：
二維分離方案如何避免出現共洗脫，以及如何在處理復雜分析物混合物時降低交叉干擾風險或減少信號抑制。
如何利用第二維通過改變洗脫條件提高質譜檢測的信號強度，從而以更適合的洗脫液將分析物引入質譜離子源，大幅提高定量限。
實驗部分
設備
Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜系統包括以下模塊：
兩臺 Agilent 1290 Infinity II 高速泵;
Agilent 1290 Infinity II Multisampler(G7167B)，配備冷卻裝置;
Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱;
Agilent 1290 Infinity 閥驅動，配備 2 位/4 通雙向閥;
兩個 Agilent 1290 Infinity 閥驅動，配備帶 40 μL 定量環的多中心切割閥;
質譜 (MS) 檢測采用配備安捷倫噴射流電噴霧離子源的Agilent 6495 三重四極桿液質聯用系統進行。
軟件
Agilent OpenLAB CDS ChemStation版，版本 C.01.07 SR2 [263] 以及二維液相色譜軟件，版本 A.01.03 [025];
Agilent MassHunter 工作站 LC/MS數據采集軟件，版本 B.08.00，Build 8.0.8023.5 SP1;
Agilent MassHunter 工作站定量分析軟件，版本 B.07.01，Build 7.1.524.0。
化學品
LC/MS 級乙腈和甲醇購自 TH Geyer;
LC/MS 分析所使用的甲酸和乙酸銨購自 Sigma-Aldrich;
新制超純水產自配置 0.2 μm 膜式終端過濾器的 ELGA Pureflex 2 水純化系統。
樣品和方法
1.利用二維液相色譜避免信號抑制和交叉干擾
進行體外細胞懸液測定，鑒定負責候選藥物代謝的關鍵酶。在細胞懸液中對候選藥物(小分子)和多種酶特異性探針底物及相應酶抑制劑進行溫育。經過一段時間后，收集樣品并分析代謝物的形成。為避免信號抑制或交叉干擾，采用色譜法對高豐度底物和抑制劑進行了分離。進樣溶液中含有細胞上清液與穩定同位素標記內標溶液的混合物。方法參數如表 1所示。
2.二維液相色譜通過溶劑切換提高質譜檢測靈敏度通過體外細胞培養測定評估母體化合物(候選藥物)及其三種主要代謝物在培養基和細胞中的濃度。在預設溫育時間結束后采集樣品，加入非穩定同位素標記的內標，然后進樣。方法參數如表 2 所示。
結果與討論
利用二維液相色譜避免信號抑制和交叉干擾
在酶底物和抑制劑存在的條件下，體外細胞懸液測定得到的細胞培養上清液中含有各種代謝物，因此屬于復雜混合物。圖 1所示為細胞培養上清液的 LC/MS/MS 分析結果。突出顯示的代謝物 M1 與濃度更高的底物和抑制劑發生了共洗脫。在此次LC/MS/MS 分析中，代謝物 M1 發生信號抑制，原因是該代謝物與豐度更高的底物和抑制劑發生了共洗脫。對于結構相關化合物，還可能有交叉干擾的問題。
要避免信號抑制和交叉干擾，分析細胞上清液時需要采用一種能夠將代謝物與底物和抑制劑分離開來的色譜方法。為確保將代謝物 M1 與共洗脫底物和抑制劑分離，采用了中心切割 (MHC) 二維液相色譜。在基于時間的模式下，對代謝物M1 進行中心切割，然后轉移至選擇性不同的第二維 (2D) 進行分離。在第二維分離中，代謝物 M1 與高豐度底物及抑制劑
發生充分分離，如圖 2 所示。代謝物 M1與高豐度底物及抑制劑的分離可避免信號抑制和交叉干擾。
利用基于時間的 MHC 二維液相色譜將16 個目標代謝物從第一維轉移至第二維。這樣可使目標化合物與底物及抑制劑進一步分離，從而使分析的總運行時間僅為 35 分鐘。如果采用一維方法將 16 個目標代謝物與底物及抑制劑分離開來，需要開發六種不同的方法，每種方法的運行時間為 25 分鐘(相關數據未顯示)。在這種情況下，MHC 二維液相色譜的使用節省了大量的時間和樣品。
二維液相色譜通過溶劑切換提高質譜檢測靈敏度
在體外細胞培養測定中，如果是一種母體化合物和一種代謝物，則必須通過基于內標的外部校準法進行定量。如果還有兩種代謝物，則必須進行相對定量，因為沒有相應分析標準品。圖 3 所示為采用現有一維 LC/MS/MS 方法得到的分析結果。
方法優化時測試了不同的色譜柱和溶劑組合。圖 4 所示為方法優化過程中得到的兩幅 LC/MS/MS 色譜圖。圖 4A 中采用的是與圖 3 現有 LC/MS/MS 方法類似的條件。在上述條件下，全部三種代謝物(M1–M3) 均實現了彼此分離以及與母體化合物和內標的分離，但所選溶劑導致質譜檢測靈敏度受到影響。向流動相中加入乙酸銨和甲醇，質譜檢測靈敏度得到大幅提升，但代謝物 M1–M3 之間的分離以及與母體化合物和內標之間的分離受到了影響，如圖 4B 所示。代謝物 M1 與 M3 的共洗脫問題尤為嚴重，因為三種代謝物的質量離子對相同，因此需要通過色譜分離。
為了達到水和乙腈流動相中加入甲酸后的分離效果，同時擁有流動相中加入乙酸銨和甲醇后的質譜檢測靈敏度，本研究利用多中心切割將兩種分離方法在二維液相色譜方法設置中進行了結合。在第一維中，將流速提高至 0.9 mL/min 以加快分析速度。圖 5 所示為最終的第一維分離結果。利用基于時間的中心切割法將五個目標峰轉移至第二維。在第二維中，采用快速梯度(第二維周期 1.0 分鐘)將化合物捕集到第二維色譜柱，然后用第二維溶劑洗脫至質譜離子源，以提高檢測靈敏度。對體外細胞培養測定樣品進行 2D-LC/MS/MS分析后得到的第二維色譜圖如圖 6 所示。與原始 1D-LC/MS/MS 方法中代謝物M1 61533 的響應值(圖 3)相比，2D-LC/MS/MS 方法中代謝物 M1 的響應值達191646(圖 6)，質譜檢測靈敏度提高了 15 倍，同時進樣量從 5 μL 降至 1 μL。2D-LC/MS/MS 分析的總運行時間從9.5 分鐘縮短至 6.5 分鐘。
結論
在藥代動力學研究中將 2D-LC/MS/MS 技術用于藥物及其代謝物的應用引入了第二維分離，因此可避免出現共洗脫，并消除上述復雜樣品中的交叉干擾風險。從體外細胞懸液測定細胞上清液的分析中已經證實了這種可能性。二維液相色譜卓越的分離能力實現了在 35 分鐘的總運行時間內對 16 種目標代謝物的分析，與采用六種不同方法對目標代謝物進行 1D-LC/MS/MS 分析的方法相比，這種方法能夠節省大量時間和樣品。
2D-LC/MS/MS 方法中第二維的使用成功提高了質譜檢測的信號強度。在該方法設置中，第一維采用能夠分離目標分析物的條件，而在第二維中選擇有助于達到絕佳質譜檢測靈敏度的條件。以更適合的洗脫液將分析物引入質譜離子源的方式大大提高了定量限。