454高通量測序——研究土壤微生物的新手段（一）

在陸地生態系統中，在土壤中生活有數量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線菌及超顯微結構微生物, 以及真核生物如真菌、藻類( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動物有著明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學反應，擔負著地球C、N、P、S 等物質循環的“調節器”^[1]、土壤養分植物有效性的“轉化器”和污染環境的“凈化器”等多方面生態功能^[2]。土壤微生物是氣候和土壤環境條件變化的敏感指標，土壤微生物群落結構和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質量。土壤微生物多樣性一般包括微生物分類群的多樣性、遺傳(基因) 多樣性、生態特征多樣性和功能多樣性^[3]。由于土壤微生物的復雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動、植物相比遠遠落后。隨著多聚酶鏈反應(PCR)、核酸測序等現代生物學分子生物學技術的迅速發展, 人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術的發展則為研究土壤宏基因組提供了大量數據，為直接探究土壤中的微生物群落結構提供了客觀而全面的信息。

一、對土壤微生物進行研究的方法

1、微生物平板培養法

傳統的土壤生態系統中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進行分離培養，然后通過一般的生物化學性狀，或者特定的表現型來分析，局限于從固體培養基上分離微生物。

這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養的微生物類群，無法對絕大多數微生物的分類地位和系統發育關系的深入研究。

2、分子生物學技術結合測序的方法

在過去的20多年里，分子生物學技術，尤其16SrDNA技術已經廣泛應用于鑒定未知菌的研究中。20世紀80年代以來, 逐步建立起了以分子系統發育分析為基礎的現代微生物分子生態學的研究方法, 如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(FISH)、基因芯片(Microarry) 、磷脂脂肪酸圖譜分析( Phospholipid fatty acid, PLFA) 、穩定同位素探針( Stable Isotope Probing, SIP) 、PCR-DGGE/TGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 等, 使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進行研究。

其中運用比較廣泛并被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測的DNA片段長度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測^[4]，PCR 擴增所需G/C 堿基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環境中優勢菌群的存在，只有占整個群落細菌數量約1％或以上的類群能夠通過DGGE檢測到^[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能完全保證將有序列差異的DNA片段分開，從而出現序列不同的DNA 遷移在同一位置的現象。

3、高通量測序方法

近年來，16S rRNA/DNA為基礎的分子生物學技術已成為普遍接受的方法^{[6,7 ]}。研究表明，400～600堿基的序列，足以對環境中微生物的多樣性和種群分類進行初步的估計^[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長（400~500bp）長和準確性高的特點大量用于微生物多樣性的研究。

有了微生物16S rDNA序列，不論是全長還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類，但更為精確的微生物分類還取決于系統發育分析(phylogenetic analysis)。

高通量測序的優越性體現在：測序序列長，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區域； 測序通量高，可以檢測到環境樣品中的痕量微生物；實驗操作簡單、結果穩定，可重復性強；無需進行復雜的文庫構建，微生物DNA擴增產物可以直接進行測序，實驗周期短；測序數據便于進行生物信息分析。

該方法得到頂級期刊的認可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶提供的土壤樣本進行高通量測序并進行生物信息學分析。高通量測序因其數據量大，操作過程簡單，盡可能避免了繁瑣的實驗操作過程所造成的樣本損失，能夠相對客觀的反應出土壤樣本的真實情況。