BrdU檢測丁細胞和B細胞增殖

基本方案

材 料

實驗動物

0.8m g / m l B r d U (Sigma) 水 溶 液（口 服用）或 4m g / m l B r d U P B S 溶 液（注射用)

P B S ， p H 7. 4

0.15mo l / L 冰冷的 NaCl

冰 冷 的 9 5 % 乙醇

多聚甲醛固定液

D N A 酶 I 溶液

抗 B r d U - F I T C (Becton Dickinson Immimocytometry)

15m m X 75m m 圓底聚苯乙烯管

能進行三色或四色分析的流式細胞儀

1 . 通 過 飲 水（將 〇 .8m g / m l B r d U 溶解在無菌飲用水中；因 B r d U 對光敏感，因此需每天更換新配的水溶液）給 予 B r d U ，或采用靜脈或腹腔注射 B r d U 濃 度 為 4m g / m l 的P B S 溶液，按附錄 2E 中的方法每只小鼠注射 0.2 ml (0.8m g )。 如果需要準確計算初始給藥時間，可同時通過注射和飲水給予 B r d U 。

2 .取淋巴器官制備單細胞懸液（單 元 2.1)。 對細胞進行免疫熒光檢測（單 元 4.1)。 如細胞已在微孔板中完成表面標記，將細胞轉移到 15m m X 75m m 試管中。

3 . 采用合適的抗體和熒光素對細胞進行表面標記。如 果 采 用 本 方 案 推 薦 的 抗 B r d U -F I T C 抗體，那么表面標記不要使用 F T T C 交聯抗體。

4 . 加 入 Iml P B S ， 4°C ， 300 g■離心 6 min。丟棄全部上清后用 0.5m l 冰 冷 的 0. 15mol/LN a C r 混懸細胞。如采用碘化丙錠區分活細胞和死細胞（單 元 4.1)，那么在固定和打孔 之 前 再 洗（步 驟 4?5) 4 或 5 遍以去除所有細胞外的碘化丙錠。

5 . 輕輕振蕩細胞，同時逐滴加入 1.2m l 冰 冷 的 9 5 % 乙醇以避免細胞聚團。冰 浴 30m i n 。加入 2 ml P B S ， 4°C ， 450 g?離心 6m i n 。

6.徹底棄上清。用 I m l 多聚甲 醛 固 定 液 混 懸 細 胞 。室 溫 放 置 30 min， 4°C ， 離心 6 min

7 . 棄上清。用 l m l D N A 酶 I 溶液混懸細胞。室 溫 放 置 10m i n 。加 入 2 m l P B S ， 4°C ，450 g 離心 6m i n

8 . 棄上清。混 懸 細 胞 后 加 入 10M 1 抗 B r d U -F I T C 抗 體 ，室 溫 孵 育 30m i n 。加 入 2 mlP B S ， 4°C ， 450 g 離心 6m i n 。

9 . 用 500M1 P B S 混懸細胞。立即進行流式細胞分析（單 元 4 . 2 ) 或 者 4°C 避光保存不超過一周。