1.1 激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理LSCM采用激光束作為光源, 通過共聚焦成像系統, 使得只有聚光鏡聚焦到樣品中某個焦點上所產生的激發熒光才能成像, 而來自焦點以外的散射光被小孔或狹縫遮擋, 無法在顯示器上面顯示熒光信號。通過計算機輔助成像系統, 采集和匯聚每一個點上的熒光信號, 形成清晰的二維圖像。由于LSCM可以通過程序控制自動調節并改變焦平面,所以可以通過光學切片改變焦平面而獲得不同切片的圖像, 通過圖像疊加, 可以獲得樣品的三維結
構。
即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式為C16 H15 N5 ·2C3 H6 O3 ，分子量457.48。DAPI 為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發揮標記的作用，可以產生比DAPI自身強20多倍的熒光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍色熒光的細胞，熒光顯微鏡熒光顯微鏡")觀察細胞標記的效率高(幾乎為100 %) 。DAPI染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。DAPI也常用于普通的細胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細胞經熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細胞核的形態變化。
DAPI 是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料。它結合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對處，一個DAPI分子可以占據三個堿基對的位置。結合到雙鏈DNA上DAPI分子的熒光強度提高大約20倍，常用與熒光顯微鏡觀測，根據熒光的強度可以確定DNA的量。另外，因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用于活細胞和固定細胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發。單獨DAPI的最大吸收波長為340nm，最大發射波長為488nm；當DAPI與雙鏈DNA結合時，最大吸收波長為364nm，最大發射波長為454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其發散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可以和RNA結合，但產生的熒光強度只有與DNA結合的熒光強度的1/5，其發散光的波長范圍約在500nm左右。
利用固定劑（通常是甲醛或多聚甲醛）將細胞固定，使得細胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白變性，從而使通透性進一步加強。利用正常羊血清封閉，可以令許多蛋白先與血清內的非特異性抗體結合，而特異性的抗體由于動力學的關系可以通過競爭性的反應與目的蛋白結合，這一過程可以保證抗體識別的特異性。二抗可以特異性識別一抗的Fc區域，利用二抗連接不同的熒光基團，就可以在熒光顯微鏡下觀察到不同的熒光，從而顯示目的基因的表達情況。另外，免疫熒光實驗由于其較高的敏感性可以顯示出基因表達的亞細胞情況(核內，核外，膜上以及一些較大的細胞器上)，所以通常被用來作為基因定位的方法。