| 實驗步驟 | 1. 離子交換劑的處理
稱取1.5 克DEAE 纖維素( DE-23 ) 干粉, 加入0 . 5 mol/ LNaOH 溶液( 約50ml) , 輕輕攪拌, 浸泡至少0.5 小時( 不超過1 小時) , 用玻璃砂漏斗抽濾, 并用去離子水洗至近中性, 抽干后, 放入小燒杯中, 加50 ml 0.5 mol/ L HCl , 攪勻, 浸泡0.5 小時, 用去離子水洗至近中性, 再用0.5 mol/ L NaOH 重復處理一次, 用去離子水洗至近中性后, 抽干備用(因DEAE 纖維素昂貴, 用后務必回收)。實際操作時, 通常纖維素是已浸泡過并回收的, 按“堿→酸”的順序洗即可, 因為酸洗后較容易用水洗至中性。堿洗時因過濾困難, 可以先浮選除去細顆粒, 抽干后用0.5 mol/ L NaOH-0.5 mol/ L NaCl 溶液處理, 然后水洗至中性。
2. 裝柱與平衡
先將層析柱垂直裝好, 在燒杯內用0.02 mol/ L, pH7.3 Tris-HCl 緩沖液洗纖維素幾次, 用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱, 然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導率與緩沖液相同或接近時即可上樣。
3. 上樣與洗脫
上樣前先準備好梯度洗脫液, 本實驗采用20 ml , 0.02 mol/ L,pH7.3 的Tris-HCl 緩沖液和20 ml 含0.2 mol/ L 濃度NaCl 的0.02 mol/ L, pH7.3 的Tris-HCl 緩沖液, 進行線性梯度洗脫。取兩個相同直徑的50 ml 小燒杯, 一個裝20 ml 含NaCl 的高離子強度溶液, 另一個裝入20 ml 低離子強度溶液, 放在磁力攪拌器上,在低離子強度溶液的燒杯內放入一個小攪拌子( 在細塑料管內放入一小段鐵絲, 兩端用酒精燈加熱封口) , 將此燒杯置于攪拌器旋轉磁鐵的上方。將玻璃三通插入兩個燒杯中, 上端接一段乳膠管, 夾上止水夾, 用吸耳球小心地將溶液吸入三通( 輕輕松一下止水夾) , 立即夾緊乳膠管, 使兩燒杯溶液形成連通, 注意兩個燒杯要放妥善, 切勿使一杯高、一杯低。
用5 ml 0.02 mol/ L, pH7.3 的Tris-HCl 緩沖液充分溶解醇級分Ⅱ (注意玻璃攪棒頭必須燒圓, 攪拌溶解時不可將離心管劃傷) , 若溶液混濁, 則用小試管, 4 000 r/ min 離心除去不溶物。取1 . 5 ml 上清液( 即醇級分Ⅱ樣品, 留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量) , 將剩余的3 . 5 ml 上清液小心地加到層析柱上, 不要擾動柱床, 注意要從上樣開始使用部分收集器收集, 每管2.5～3.0 ml/ 10 min。上樣后用緩沖液洗兩次, 然后再用約20 ml 緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質, 至A280 降到0.1 以下, 夾住層析柱出口, 將恒流泵入口的細塑料導管放入不含NaCl 的低離子強度溶液的小燒杯中, 用膠布固定塑料管, 接好層析柱, 打開磁力攪拌器, 放開層析柱出口, 開始梯度洗脫, 連續收集洗脫液, 兩個小燒杯中的洗脫液用盡后, 為洗脫充分, 也可將所配制的剩余30 ml 高離子強度洗脫液倒入小燒杯繼續洗脫, 控制流速2.5～3.0 ml/ 10 min。
測定每管洗脫液的A280 光吸收值。
4. 各管洗脫液酶活力的定性測定
在點滴板上每一孔內, 加一滴0.2 mol/ L, pH4.9 的乙酸緩沖液, 一滴0.5 mol/ L 蔗糖和一滴洗脫液, 反應5 min , 在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙, 10～ 20 min 后觀察試紙顏色的變化。用 + 號的數目, 表示顏色的深淺, 即各管酶活力的大小。合并活性最高的2～3 管, 量出總體積, 并將其分成10 份,分別倒入10 個小試管, 用保鮮膜封口, 冰凍保存, 使用時取出一管, 此即 柱級分Ⅲ。
注意: 從上樣開始收集, 可能有兩個活性峰, 梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物, 本實驗取用梯度洗脫開始后洗下來的活性峰。
在同一張圖上畫出所有管的酶活力、NaCl 濃度( 可用電導率代替) 和光吸收值A280 的曲線和洗脫梯度線。
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