目的
對于許多重組DNA的實驗，知道DNA的序列常是進一步操作所必備的。 本實驗將定出你所選殖之cDNA的序列，并進行數據庫比對分析。其目的在教導學生如何從事DNA定序分析及DNA序列的計算機分析。
原理
本實驗所使用之方法為F. Sanger所發展之dideoxy定序法。 此法乃是將一引子黏合到欲定序之DNA模板上，再利用DNA聚合脢行聚合反應，直到加入一dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP)而中斷。 每一定序分析須執行四組反應，每一反應含有所有四種deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP)及限量之一種ddNTP。 由于ddNTP缺少核酸鏈聚合所需之3’-OH基，四組反應中的核酸鏈將會分別停在A、 G、 C或T。 dNTP和ddNTP的相對濃度可調整至所產生中斷鏈的長度范圍從數十到數百個核甘酸。然后，利用高解析力之定序膠體電泳將四組反應產生之DNA片段依長度大小分開，即可讀出DNA序列。
材料
RNase A：10 mg/ml水溶液。
30% polyethylene glycol (PEG) 6000/1.5 M NaCl
2 M NaOH/2 mM EDTA
3M sodium acetate (pH 5.3)
下列試劑來自United States Biochemical公司所售之Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit：
o Sequenase Reaction Buffer (5X concentrate)：200 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM MgCl2，250 mM NaCl
o pUC/M13 forward (-47) primer： 5'-d(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3'
o 四種Termination Mix： 均含50 mM NaCl，80 M dATP，80 M dGTP，80 M dCTP，80 M dTTP，并各含8 M ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP
o 0.1 M dithiothreitol(DTT)
o Labeling Mix (5X concentrate)： 7.5 M dGTP，7.5 M dCTP，7.5 M dTTP
o Enzyme Dilution Buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，5 mM DTT，0.5 mg/ml BSA
o Sequenase Version 2.0 T7 DNA polymerase：13 units/l in 20 mM KPO4 (pH7.4)，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% glycerol
o Stop Solution： 95% formamide，20 mM EDTA，0.05% bromophenol blue，0.05% xylene cyanol FF
10 mCi/ml [35S]dATP：購自Amersham公司
40% acrylamide/bis-acrylamide(19:1)溶液
urea
10X TBE buffer：890 Mm Tris-borate，890 mM boric acid，20 mM EDTA
10% ammonium persulfate
TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine)
X光片：Kodak公司之BioMax MR
操作步驟
1. 欲定序之模板DNA的準備： 你已將前面實驗所選殖之cDNA送入pGEM-T Easy載體內，并已少量制備此質體DNA。 取1-2 g DNA (溶于30 l TE)，加入RNase A 使其最終濃度為20 /ml，于37 oC作用15分鐘。 加入10 l 30% PEG-6000/1.5M NaCl劇烈震蕩后，置于冰上60分鐘。 再于4oC 12,000 g離心10分鐘。倒掉上清液，用1 ml 70% ethanol清洗，于12,000 g離心3分鐘，倒掉上清液。 再用1 ml 95% ethanol清洗，于12,000 g離心3分鐘，倒掉上清液。 真空抽干后，以10 l TE回溶DNA沈淀。
2. 加入1 l 2 M NaOH/2 mM EDTA到步驟1之DNA溶液內，于37 oC作用30分鐘，使DNA變性。 然后加入1 l 3M sodium acetate (pH 5.3)以中和溶液。 再加入30 l 95% ethanol將DNA沈淀，置于-70 oC 15分鐘，于4oC 12,000 g離心10分鐘。 倒掉上清液，用1 ml 70% ethanol清洗，于12,000 g離心3分鐘，倒掉上清液。 真空抽干后，回溶在7 l蒸餾水中。
3. 加入2 l Sequenase Reaction Buffer及1 l primer到步驟2之DNA溶液內，混和后，加熱至65 oC作用2分鐘。 再于室溫自然冷卻至低于35 oC，以進行DNA與引子的黏和作用，其冷卻時間需大于30分鐘。
4. 在等待DNA溶液冷卻的時候，取四根微量離心管分別標識為A, G, T, C，并分別加入2.5 l內含ddATP，ddGTP，ddTTP或ddCTP之Termination Mix。 置于室溫下，等待以下之步驟5。
5. 加入下列物質至在已冷卻之DNA溶液中：1 l 0.1 M dithiothreitol，2 l 1X Labeling Mix，0.5 l 10 mCi/ml [35S]dATP及2 l Sequenase稀釋液(1:8稀釋于Enzyme Dilution Buffer)。 置于室溫2-5分鐘，各取3 l放入步驟4內含2.5 l Termination Mix之微量離心管中。 于37 oC作用5分鐘后，各加入4 l Stop Solution。
6. 定序膠體之制備：混合下列試劑于三角椎瓶中：9 ml 40% acrylamide/bis-acrylamide(19:1)溶液，25.2 g urea，6 ml 10X TBE buffer，約10 ml去離子水。 置于熱板上加熱使urea溶解，加水至總體積為60 ml，過濾去除不溶之雜質，再抽氣除去溶液內之氣體。 最后，加入300 l 10% ammonium persulfate及30 l TEMED，混合后立即倒入預先裝置好之兩片玻璃板間，若有氣泡則輕敲玻璃趕出。插上齒梳后等待膠體凝聚，此為含7 M urea之6% polyacrylamide定序膠體。
7. 將電源供應器(GIBCO BRL model 4000)設定最大電力為1900 V，70 W，100 mA，預熱膠體約30分鐘。 將已完成定序反應之DNA樣品加熱至75 oC作用2分鐘，取3 l加載膠體作電泳分離。 適當時間后，取下膠體，貼于Whatman 3MM濾紙上并蓋上保鮮膜。再置于膠體干燥器(gel dryer; Model AE-3750, Atto Corporation, Japan)，于80 oC真空干燥 1小時后，置于片夾內壓上X光片2-3天，再顯影以分析DNA序列。
結果及討論
1. 讀出你所選殖之cDNA的序列，并嘗試將核酸序列轉譯為埯基酸序列。
2. 將DNA及蛋白質序列與數據庫(如GenBank, EMBO)內已知之序列作比對，以判別其為未知序列、已知序列、或與已知序列類似之序列。此等訊息將有助于進一步對其功能之探討。
3. 其它你認為值得討論之發現。