實驗材料 質粒DNA
試劑、試劑盒 dNTPDNA聚合酶Klenow酶TETAE溴化乙錠TEMED過硫酸銨BSA
儀器、耗材 培養箱離心管
實驗步驟
1. 用一種或多種限制性內切酶在100 μl 體積中消化10 μg 質粒人，產生25~100 bp 的含有結合位點的DNA片段，并至少有一端是5’突出的。
2. 加100 μCi［α-32P］dNTP，4μl 5 mmol/l 3種NTP的混合液，2.5U Klenow酶。室溫溫育20 min。
3. 加4 μl 含有5 mmol/l 與被標記的相同的dNTP溶液，室溫溫育5 min。
4. 沉淀DNA，溶解于TE中。
5. 加10×加樣緩沖液，用2%小型瓊脂凝膠（含溴化乙錠5 μg/ml）在TAE或TBE緩沖液中進行電泳。
6. 在長波透射紫外燈下觀察電泳帶。在帶的下游切一平行縫隙，插入一片DEAE膜（先在凝膠緩沖液中浸濕）。將膜緊擠于膠中，繼續電泳直到泳動至膜上。
7. 將膜在電泳緩沖液中洗一下，在濾紙上吸干。將膜放入1.5 ml 螺口蓋的圓底管底部，其中裝有400 μl DEAE洗脫液，68℃水浴30 min。
8. 將洗脫液移入1.5 ml 的離心管中，4℃微量離心15 min。將上清轉入干凈管中，留10 μl 于原管管底。
9. 在上清中加入4 μl 1 mol/l MgCl2。用1 ml 100%乙醇沉淀DNA，重懸于100 μl TE緩沖液中。
10. 取1 μl 測定cpm/μl min，用溴化乙錠打點法定量估計DNA濃度。
11. 安裝16 cm 長的電泳玻璃板和1. 5 mm 厚的墊片。在40 ml 低離子強度凝膠混合液中加100 μl 30%的過硫酸銨及34 μl TDMED，灌入玻璃板之間，插入齒寬≥7 mm 的梳子。讓膠聚合20 min。
12. 將梳子和底邊的墊片取出。將膠放入盛有低離子強度電泳緩沖液的電泳漕中，用雙頭泵以5~30 ml/min 循環電泳緩沖液。100 V（約22mA）預電泳90 min以上，
13. 在微量離心管中，加終體積15 μl 的下列成分：10 000 c/min 的DNA探針，終濃度300 μg/ml BSA，及取自緩沖液中的粗制蛋白提取物中的大約15 μg 蛋白質。混勻，置30℃水浴15 min。
14. 在1個加樣孔加入少量10×加樣緩沖液并讓染料跑進膠。在其他孔中加各結合反應液，在約30~35mA下電泳，直至溴酚藍（相當于約70 bp 的條帶）達到膠底。
15. 卸下凝膠電泳裝置，撬開電泳玻璃板，將粘附了凝膠的玻璃板平放在實驗臺上，在膠上放置3張Whatman 3MM濾紙。將濾紙連同凝膠一起揭下。
16. 用塑料薄膜包裹凝膠進行真空干燥。在不使用增感屏的條件下，凝膠膜放射自顯影過夜，或用增慼屏放射自顯影2~3 h。