DNA的轉化實驗

體外通過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質粒，選用轉化和篩選技術， 可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，DNA可在生物體系中大量擴增，繁殖， 保存以及表達目的基因的產物，這是ＰＣＲ體外擴增DNA所不能替代的。配合DNA重組技術，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應用于科研，醫藥生產和生物發酵等領域。

質粒轉化不同細菌有不同的轉化效率，轉化效率的高低與實驗的成敗直接相關， 通常轉化效率可達１０５－１０７轉化子/μg DNA。獲得高轉化效率的關鍵是感受態體菌的制備。感受態就是細菌吸收轉化因子的生理狀態，只有發展為感受態的細胞才能穩定攝取外來的DNA分子。pUC18的LacZ基因區域當有DNA   片段插入時，LacZ基因失活，轉化進入大腸桿菌并在含有IPTG和X-gal培養基生長時，會產生白色的克隆，不含插入片段的pUC18質粒進入宿主細胞生成藍色菌落。

DNA分子轉化分以下幾步：

1、 吸附--雙鏈DNA分子吸附于受體菌表面；

2、 轉入--雙鏈DNA分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解；

3、 自穩--外源質粒DNA分子在細胞內復制成雙鏈；

4、 表達一供體基因隨同復制子同時復制，分裂， 轉錄翻譯。

實驗試劑：

LB培養基
質粒DNA（含Amp抗生基因），受體菌
CaCl2 0.1M
Amp

實驗過程：

1、 感受態細胞制備及CaCl2處理：

1） 將宿主菌在瓊脂培養基平板上劃線，３７℃培養１６～２０小時。
2） 挑取單菌落轉入２０ｍｌ ＬＢ培養基錐瓶中，３７℃振蕩過夜。
3） 從中取２ｍｌ菌液轉入５０ｍｌ ＬＢ培養基中３７℃振蕩培養４－５小時， 測ＯＤ１００達０．４～０．５。
4） 培養物于冰上１０分鐘。
5） 轉入－５０ｍｌ離心管，于４０００ｒｐｍ下４℃離心１０分鐘。
6） 棄上清，倒置離心管１分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上１０分鐘。
7） 4,000rpm 4℃離心１０分鐘，棄上清。
8） 加入2ml，0.1M CaCl2懸浮細胞，于４℃過夜。

2、 倒皿鋪平板 ：

1） 按照各組轉化反應的混合物，控制不同的選擇性培養基（20 ml/皿） 。LB固體培養基（100 ml） Amp（60μg/ml） Tet（40μg/ml）供連接混合物轉化，pUC18轉化用, 共5皿 LB固體培養基 （100 ml） Amp （60μg/ml） X-gal （40μg/ml） IPTG（24μg/ml）,供連接混合物轉化，pUC18轉化用,共5皿 。
2） 轉化反應前一天，先鋪好平板 。
3） 取各組反應物在平板上涂布 。
4） 培養皿倒置于37℃培養箱中過夜 。
5） 觀察轉化子出現的情況 。

3、 轉化：

1） 將3只Eppendorf管按下列轉化項目作好標記，溫和混勻，于冰上３０分鐘

2）于４２℃水浴９０秒。
3） 冰浴２分鐘。
4） 加入８００μl ＬＢ 液體培養基３７℃ ４５分鐘。
5） 分別取3組反應物各50μl在含相應抗生素的固體LB培養基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養過夜。

注意事項：細菌細胞經特殊試劑處理后在適當的條件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產物通過熱刺激或電脈沖轉化感受態細胞，當細菌大量增殖的同時，導入的重組DNA也得到增殖。