DNA的重組連接實驗原理和步驟

一、實驗目的

用T4DNA連接酶將載體pBR322 EcoR Ⅰ-CIP處理的DNA片段，與目的基因5.4KbEcoR Ⅰ片段連接起來，構建體外重組DNA分子，同時學習幾種DNA連接的方法。

二、實驗原理

重組的DNA分子是在T4DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖液系統中，將上述二種酶切后的DNA分子進行連接。

（一）DNA連接酶的作用步驟

1．T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶－AMP復合物（腺苷酰酶）

2．酶－AMP復合物再結合到具有5′-磷酸基和3′-羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。

3．產生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來。

（二）DNA的連接方式

在T4DNA連接酶的作用下的DNA連接反應，一般是隨機的，但也可以通過對載體、目的基因的處理以控制與調整DNA的有效連接。

連接的方式有：

1．自連

2．兩種片段相連

3．三個片段以上的自連與互連

（三）連接反應的條件

1．緩沖液：一般商品酶都帶有10倍的緩沖液，有Mg2＋、ATP作為輔助因子，提供能量，同時也有些保護與穩定酶活性的物質，如DTT（二硫蘇糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清蛋白）維持一定的蛋白量，以防止因蛋白濃度太低的酶變性失活。

2．溫度：連接反應溫度在37℃時有利于連接酶的活性，但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的，EcoR Ⅰ酶所產生的末端，僅僅通過四個堿基對相結合，這不足以抵抗該溫度下的分子熱運動。因此在實際操作時，DNA分子粘性末端的連接反應，其溫度是折中采取催化反應與末端粘合的溫度，為12～16℃。

3．時間：12～16℃ 12～16小時（過夜）；或7～8℃ 2～3天。

三．實驗材料

1．pBR322 EcoR Ⅰ-CIP處理DNA片段。

2．5.4Kb含有Str的EcoR Ⅰ回收DNA片段。

3．T4DNA連接酶
四．實驗儀器、器皿及試劑

儀器、器皿（見附錄）

試劑：10×T4DNA連接酶緩沖液

660mmol/L Tris-HCl(pH7.5)

50 mmol/L MgCl2

50 mmol/L DDT

50 mmol/L ATP

五．實驗步驟

1．取3只Eppendorf管，一管做重組連接，一管做pBR322未經CIP處理的自連，另一管做pBR322經CIP處理的自連。

2．用微量進樣器按下表分別取樣各溶液于Eppendorf管中。。

加樣順序為ddH₂O，10×T₄緩沖液，DNA片段，最后加T₄DNA連接酶（放于冰浴中）連接酶取好后應立即放回－20℃保存。

3．蓋緊蓋子用手指彈勻Eppendorf管，于臺式離心機上轉2秒鐘，以集中樣品。

4．將3管連接樣品放入溫度12℃恒溫水浴鍋中，過夜。

5．第二天上午各管取約25ng的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察連接反應效果，電泳時要加入pBR322 EcoR Ⅰ酶切片段作電泳對照。