實驗材料 樣品
試劑、試劑盒 雙氧水PBS蛋白酶KRNA酶DTTdNTPKClMgCl2Tris·Cl
儀器、耗材 加濕盒熱循環儀
實驗步驟
1. 將載有固定樣品的載玻片置105℃加熱塊上5~120 s。
2. 載玻片放入含0.3%H2O2中，于37℃或室溫溫育過夜，以滅活內源性過氧化物酶活性，然后以PBS洗1遍。
3. 取1 mg/ml 的蛋白酶K稀釋于150 ml PBS（終濃度6 μg/ml），將玻片浸于此液中，室溫溫育5 min 后，400×顯微鏡下觀察細胞，如多數待檢細胞呈現小“圓泡”、 “斑點”或“胡椒粒”狀，可馬上進行步驟4操作。溫育5 min 后，如未出現上述情形，亦可繼續溫育，時間可長至60 min，待細胞表面呈小氣泡狀時，及時進行步驟4。
4. 在95℃加熱載玻片2 min 以滅活蛋白酶K。然后浸于PBS中10 s、水中10 s，再晾干載玻片。
5. 加10 μl 無RNA酶的DNA酶液至載玻片各樣品上，放加濕盒中，于37℃溫育過夜。
6. 用沖洗緩沖液洗片1次，然后以DEPC處理的水冼2次，晾干。
7a. 如使用AMV或MoMuLV 反轉錄酶：配置如下反轉錄體系（總體積20 μl）
（1）2 μl 10×AMV/MoMuLV RT緩沖液（1×）
（2）2 μl 10 mmol/l 4種dNTP混合液（終濃度1 mmol/l）
（3）0.5 μl 40 U/μl RNasin（終濃度1 U/μl）
（4）1.0 μl 20 μmol/l 下游行物（終濃度1 μmol/l）
（5）0.5 μl 20 U/μl AMV或MoMuLV 反轉錄酶（終濃度0.5 U/μl）
（6）8 μl DEPC處理過的水
7b. 如使用SuperScript 2反轉錄酶：配置如下反轉錄體系（總體積20 μl）
（1）4 μl 5×反應緩沖液（隨酶提供：1×終濃度）
（2）2 μl 10 mmol/l 4dNTP混合液（終濃度 1 mmol/l）
（3）0.5 μl 4 U/μl RNasin（終濃度 0.1 U/μl）
（4）1.0 μl 20 mmol/l 下游引物（終濃度 1 μmol/l）
（5）0.5 μl 20 U/μl SuperScript 2（終濃度0.5 U/μl）
（6）1.2 μl 0.1 mol/l DTT（終濃度6 mmol/l）
（7）4.8 μl DEPC處理過的水
8. 加10 μl 反轉錄酶體系于載玻片各樣品上，并小心蓋上20 mm×60 mm 的蓋玻片，放一加濕盒中，于42℃或37℃溫育1 h。
9. 在92℃加熱塊上溫育玻片2 min，移去蓋玻片并用水洗玻片2次。
10. 配置如下擴增體系（總體積100 μl）
（1）5 μl 25 μmol/l 正向引物（終濃度1.25 μmol/l）
（2）5 μl 25 μmol/l 反向引物（終濃度1.25 μmol/l）
（3）2.5 μl 10 mmol/l 4dNTP混合物（每種dNTP終濃度200 μmol/l）
（4）1.0 μl 1.0 mol/l Tris·Cl，pH8.3（終濃度10 mmol/l）
（5）5.0 μl 1.0 mol/l KCl（終濃度50 mmol/l）
（6）2.5 μl 100 mmol/l MgCl2（終濃度2.5 mmol/l）
（7）10 μl 0.01%明膠（終濃度0.001%）
（8）2 μl 5 U/μl Taq DNA聚合酶（終濃度0.1 U/μl）
（9）66 μl 水
11. 用20 μl 吸頭加8 μl（如用3孔載玻片）或12~20 μl （如用單孔載玻片）原位PCR擴增體系于各孔上，該液體覆蓋整個孔表面。
12. 放20 mm×60 mm 蓋玻片于每一載玻片上，小心用指甲油封住蓋玻片邊緣。
13. 在92℃加熱塊上，溫育玻片90 s。然后轉至熱循環儀。
14. 按如下擴增循環或其他最佳的條件進行PCR
（1）30個循環：30 s，94℃（變性）
（2）1 min，約45℃（退火）
（3）1 min，72℃（延伸）
（4）最后一步：不定4℃（維持）
15. 由熱循環儀上取下載玻片，浸于100%乙醇中≥5 min 溶解指甲油，用剃須刀或其他小刀橇開蓋玻片，刮去殘留的指甲油，以便在雜交/檢測步驟中能平放上新的蓋玻片。
16. 在92℃加熱塊上溫育玻片1 min，然后于室溫下用2×SSC浸泡5 min。玻片在4℃可存敢2~3周。