E2DapUbDha能夠與E3酶Nedd4和Parkin實現有效交聯

　　泛素化作為最為復雜的蛋白質翻譯后修飾形式之一，在多種細胞過程中發揮關鍵調控作用。經典的泛素化過程依賴于E1-E2-E3酶高度有序的級聯反應來完成。其中，泛素E3連接酶直接負責識別底物蛋白并將其泛素化，在決定泛素修飾特異性方面扮演關鍵角色。半胱氨酸依賴型 (HECT, RBR) E3酶發揮活性時，需首先形成瞬時動態的E3~E2~Ub硫酯中間體。近期人們開發了一系列基于活性的E2-Ub探針，用來捕獲E3-E2-Ub硫酯轉移中間體，為研究E3酶的催化機制提供了機遇。然而，現有的E2-Ub活性探針均依賴于通過綴合化學反應修飾表達的E2變體來獲取，使得探針結構的可塑性受到重組技術以及綴合化學的限制。

　　近日，清華大學劉磊教授團隊使用基于蛋白酰肼法的蛋白質化學全合成方法，發展了一種新結構的E2Dap-UbDha蛋白質探針。功能研究表明該探針能夠與E3酶Nedd4和Parkin實現有效交聯，進一步機制研究為Parkin催化E2~Ub轉硫酯反應的分子機制提供了新線索。

　　在具體的研究中作者首先利用微波固相合成法，高效率合成了三個多肽酰肼片段。隨后經過三步蛋白酰肼連接，一步脫硫以及一步Dha生成反應，作者以5%的總產率高效制備了新型Ubch7Dap-UbDha探針。探針的結構經HPLC、ESI-MS、FPLC、SDS-PAGE等手段得到確證。

　　SDS-PAGE以及HPLC-MS結果顯示，Ubch7Dap-UbDha探針能夠與HECT家族E3酶Nedd4基于活性高效交聯，從而實現Nedd4-Ubch7-Ub中間體的捕獲。針對Nedd4-Ubch7-Ub復合物的化學交聯質譜研究表明，Nedd4-Ubch7-Ub采取了一種閉合的空間構象。

　　Ubch7Dap-UbDha探針能夠與RBR家族E3酶pParkin基于活性交聯，從而形成pParkin-Ubch7-Ub硫酯轉移中間體。化學交聯質譜分析pParkin-Ubch7-Ub復合物的結構表明，在轉硫酯過程中，pParkin Helice2可能與Ub Ile44疏水口袋相互作用，進而起到穩定E2-Ub的作用。

　　在該工作中，劉磊教授團隊設計并合成了一種新型E2Dap-UbDha 蛋白質探針，展示了蛋白質化學合成在獲取新結構活性交聯探針工具上的應用。該探針豐富了泛素探針工具箱，為半胱氨酸型E3酶的結構機制研究提供了新機遇。