1、加樣
在 ELISA 中,除了包被外,一般需要進行4～5次加樣。加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性,直接影響檢測結果。由于吸嘴的構造特殊,導致清洗困難,加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經常清洗,定期校準。加樣時應將所加物加在 ELISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出。
2、保溫
在建立 ELISA 方法時,實驗表明,兩次抗原抗體反應一般在37℃經1～2h,產物的生成可達頂峰。為避免蒸發,板上應加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,反應板不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。試劑盒溫育是在空氣浴中完成的,采用水浴會造成值偏高或花板。另外,溫育中還有邊緣效應,邊上的值會偏高,建議為了客觀的判斷結果,將質控放在非邊緣位置。96孔酶標板的結構特別,易產生邊緣效應,抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格的要求,酶標板周圍與內部孔升降溫度的速率不同,造成周邊與內部孔的結果差異;干浴與水浴存在明顯的差異,盡可能使用水浴,并要求固相板放入水中,減少受熱不均,貼密封膜,防止污物浸入,待對照管顯色適當時,即可終止酶反應。
3、洗滌
洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟,但決定著實驗的成敗。ELISA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在 ELISA 操作中,洗滌是最主要的關鍵技術,應引起操作者的高度重視,操作者應嚴格按要求洗滌,不得馬虎。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團,也含親水基團,其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合,從而削弱蛋白質與固相載體的結合,并借助于親水基團和水分子的結合作用,使蛋白質回復到水溶液狀態,從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%～0.2%之間,高于0.2%時,可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而降低試驗的靈敏度。洗液需要稀釋,應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質量的純化水,電導率小于1.5μS/cm,洗液如果結晶應待其溶解后配制。洗滌條件的一致性較差,對結果的影響較大,防止洗液在孔內形成氣泡。半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結果,血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針孔全阻塞或半阻塞,造成未結合標記酶洗脫不徹底,導致“花板”,造成假陽性或假陰性,所以操作洗板機的過程中要不時觀察洗板機針孔內洗液的通暢狀況,及時糾正,洗板機不用時應用去離子水清洗幾遍。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法:吸干孔內反應液;將洗滌液注滿板孔;放置2min,略做搖動;吸干孔內液,也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數一般為3～4次,有時甚至需洗5～6次。
4、比色
TMB 經 HRP 作用后,約 40min 顯色達頂峰,隨即逐漸減弱,至 2h 后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12～24h)不褪,是目前判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光度。酶標比色儀簡稱酶標儀,通常指專用于測讀 ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001,準確性為±1%,重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下,操作時室溫宜在15～30℃,使用前先預熱儀器15～30min,測讀結果更穩定。
測讀數值時,要選用產物的敏感吸收峰,如 OPD 用 492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀,即每孔先后測讀兩次,第一次在最適波長(W1),第二次在不敏感波長(W2),兩次測定間不移動 ELISA 板的位置,最終測得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。肉眼判斷結果時,顯色淺不易觀察,影響結果的準確性,必須使用酶標儀檢測,以保證結果的一致性。
5、結果判定
(1)目測定性法:加入底物經酶解和終止反應后,肉眼觀察陽性孔的顏色明顯深于(競爭法則淺于)陰性對照;與陰性對照的顏色接近者,判定為陰性。
(2)直接以吸光度表示:吸光度越大,陽性反應越強,此數值是固定試驗條件下得到的結果,而且每次都伴有參考標本。
(3)以 P/N 值(陽性孔 OD 值/陰性孔 OD 值)表示:P/N 大于或等于2.1為陽性;P/N 值小于2.1而大于1.5為可疑;P/N 小于1.5為陰性。
(4)定量測定結果可根據標準曲線計算樣品中待測物的含量。
(5)以終點滴度表示:將標本稀釋,最高稀釋度仍出現陽性反應(即吸收值仍大于規定吸收值時),為該標本的滴度。