產品詳細描述
在 3 小時內完全轉化富含 GC的 DNA.
兩次加熱變性的反應步驟簡化了由未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶的過程 .
沒有DNA 沉淀.并且通過柱層析一步完成DNA的純化和脫硫.
洗脫的超純 DNA 對于一系列的分子生物分析是非常理想的。
描述
EZ DNA Methylation-Gold KitTM 是我們 EZ DNA Methylation Kit產品的改進版. EZ DNA Methylation-Gold Kit 將 DNA 變性過程和亞硫酸氫鹽轉變過程轉化為一步.此步驟采用溫度變性來取代以前方案中使用氫氧化鈉的化學變性過程. 經過DNA亞硫酸氫鹽轉變,試劑盒可大量回收到 DNA .兩種試劑盒都是基于在胞嘧啶與亞硫酸氫鈉之間發生的使胞嘧啶轉變為尿嘧啶的三步反應. EZ DNA Methylation-Gold 與 EZ DNA Methylation Kits 都采用創新的柱內脫磺酸技術來減少不必要的DNA沉淀步驟以便每次都可以提供給研究人員較好的結果.試劑盒的設計可以減少模版降解和純化過程中的DNA損失, 并且完全轉化未甲基化的胞嘧啶.回收的DNA對于PCR擴增、限制性內切酶消化、測序、微陣列等下游分析是很理想的. 右圖是 EZ DNA Methylation-Gold Kit所呈現出的結果.
在經過亞硫酸氫鹽處理后的DNA 測序結果. 使用EZ DNA Methylation-Gold Kit處理的甲基化的CmpG (在 #5核苷酸位點)DNA.回收的DNA通過PCR來擴增并且直接測序.在 #5位置上甲基化的胞嘧啶仍然保持完整,當未被甲基化的胞嘧啶 (i.e., positions #7, 9, 11, 14 and 15)通過亞硫酸氫鹽處理完后全部轉化為尿嘧啶.
試劑制備
CT Conversion Reagent的制備 試劑盒中所提供的CT Conversion Reagent是固體混合物并且一定要在首次使用前制備好. 通過添加 900 μl 水, 50 μl 的 M-Dissolving Buffer, 和 300 μl 的 M-Dilution Buffer 到一管的CT Conversion Reagent中. 在室溫下溶解并且震蕩10分鐘或在搖床上搖動10分鐘. 如果看到沒有溶解的試劑是很正常的, 因為在溶液中的 CT Conversion Reagent 已經達到飽和狀態.在使用之前將 CT Conversion Reagent 溶液在室溫 (20°C -30°C)下避光保存.每管的 CT Conversion Reagent 是針對10次 DNA 處理設計的.為了得到較好的結果, CT Conversion Reagent 應當在制備后立即使用.如果不立刻使用的話, CT Conversion Reagent 溶液可以在-20°C存儲1星期.而且在使用之前存儲的 CT Conversion Reagent 溶液一定要在室溫下解凍并且通過震動或顛倒2分鐘來混合. CT Conversion Reagent 對光很敏感,所以要盡量減少在光下的暴露.
M-WASH BUFFER的制備 添加24ml (對于200次的D5006應為96ml) 100%的乙醇到M-WASH BUFFER中來制備最終可以使用的M-WASH BUFFER
Protocol
每次制備的DNA 范圍在 500 pg 到 2 μg之間. 最佳量為200-500 ng.
在PCR管中添加 130 μl 的 CT Conversion Reagent 到每 20 μl DNA 樣品中. 如果 DNA 樣品的體積小于 20 μl, 則用水來彌補差量. 通過輕彈試管或移液器操作來混合樣品.
For Example: 4 μl DNA 樣品, 加入16 μl 水, 130 μl CT Conversion Reagent
Note: 對于 DNA 體積 >20 μl, 就要調整 CT Conversion Reagent的制備過程. 對于每增加 10 μl DNA樣品體積來說，水的量就要隨之減少 100 μl. 例如, 40 μl DNA 樣品, 就要添加 700 μl來制備 CT Conversion Reagent. DNA 樣品的最大體積為每次轉化反應50 μl. 不要調整 M-Dissolving Buffer 或 M-Dilution Buffer的體積.
將樣品管放到循環變溫器并按以下步驟操作:
1. 98°C 放置 10 分鐘
2. 64°C放置2.5 小時
3. 立刻進行下述操作或者在4°C 下存儲(最多20小時).
添加 600 μl 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin IC Column 中，并將柱放如試劑盒所提供的Collection Tube中.
裝填樣品 (從步驟 2)到 Zymo-Spin IC? Column 含有 M-Binding Buffer. 蓋上蓋將柱顛倒數次來混合樣品.
全速 (>10,000 x g)離心 30 秒. 去除流出液.
添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速離心30 秒.
添加 200 μl 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室溫 (20 °C -30 °C) 下放置 15-20 分鐘. 在培養后, 全速離心 30 秒.
添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速離心30 秒. 再添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 并且離心 30 秒.
直接添加 10 μl 的 M-Elution Buffer 到柱基質中. 將柱放置在 1.5 ml 的管中. 全速離心來洗脫 DNA.
DNA 可立刻進行分析或儲存在低于-20°C 下以備以后使用. 我們建議您對于每次PCR使用 2 -4 μl洗脫的 DNA.