IHC全攻略3：固定劑的選擇

　　IHC/ICC實驗中使用的所有樣本必須經過固定，以維持組織形態，并保留目的分子的抗原性。固定改變了組織的化學組成，因此往往需要在維持組織結構和保留表位之間進行折衷。細胞或組織的不完全固定(固定不足)可能造成組織內目的蛋白的快速水解，并降低了特異的免疫反應性。然而，過度的固定(固定過度)可能導致表位的遮蔽或強的非特異背景染色，這可能會掩蓋特異的標記。

　　理想的固定劑當然是：最好地保持細胞和組織的形態結構，并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而，迄今為止尚無一種標準固定液能用于各種不同的抗原固定。經同一固定液固定后，不同組織可能呈現截然不同的染色結果。因此，不同的抗原和樣本必須反復試驗，選擇最佳的固定劑。

　　甲醛

　　甲醛是保留組織和細胞內蛋白靶點的最常用固定劑。甲醛介導的組織固定被認為依賴于蛋白-蛋白以及包含亞甲基橋(-CH2-)的蛋白-核酸交聯的形成。甲醛能化學連接NH2(氨基)和CONH(肽段)基團，NH2和NH，或NH2和NH2基團。

　　甲醛是大多數IHC/ICC應用的良好選擇，但并不是一種通用的固定劑。甲醛的固定過度會修飾氨基酸(屬于表位中的一部分)，并阻斷抗體與之結合。然而，在大部分情況下，利用抗原修復技術可暴露表位，以還原抗體結合。研究還表明甲醛會誘導磷酸化依賴表位的細胞內轉位，從細胞膜轉移至細胞質。在這種情況下，冰預冷的無水甲醇或無水乙醇是適當的替代。

　　注意：甲醛溶液應當分裝并凍存，或儲存在4-8?C不超過一個月。

　　醇類

　　最常用于細胞和組織固定的醇類是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子結構與水相似。因此，它們與水競爭蛋白氫鍵，取代組織中的水分子。這通過降低蛋白的介電常數，使蛋白在等電點沉淀，并由于構象的改變，阻斷抗體-表位的結合。盡管醇類通過打斷氫鍵而影響蛋白的三級結構，但它們似乎能穩定蛋白的二級結構。

　　不過，通常認為醇類不像甲醛固定劑那樣保留組織形態。醇類不像甲醛那樣滲透，主要用于固定冰凍組織切片和細胞。因此，醇類固定更適合膜表面抗原。在醇類固定之后不推薦進行抗原修復，因為它通常認為太過劇烈，有可能損害組織切片或細胞的完整性。

　　丙酮

　　丙酮是一種強的脫水劑，能引起組織蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷凍組織的切片。

　　組織的固定

　　在研究小動物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整組織時，整個動物的灌注固定是保留抗原的最佳方法。它包括用固定液來取代動物的全身血液。然而，整個動物的灌注還不足以固定目的組織。在這些情況下，解剖的組織可浸潤在固定劑中。例如，4%甲醛是組織灌注和浸潤固定的常用溶液。

　　為了在浸潤固定過程中加強固定劑的滲透，建議組織厚度不超過10 mm。對于完整的固定，固定劑的體積應當是組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進行4-24小時。由于固定不足或固定過度可能降低或破壞組織的免疫反應性，因此優化固定條件很重要。

　　培養細胞的固定

　　與組織樣本不同，培養細胞的固定時間更短，且固定液的濃度更低。例如，用2%甲醛溶液在室溫下固定20分鐘，常常足以保留細胞形態和抗原性。

　　培養細胞的固定通常只是去除培養基，并加入固定液即可。不過，去除培養基后表面張力的變化可能損害某些細胞類型。如果是這種情況，固定劑可直接加入培養基中。例如，加入與培養基相同體積的4%甲醛，將得到2%甲醛溶液，它足以預固定細胞。在2分鐘后，預固定培養基應當替換成新鮮量的2%固定劑。預固定步驟讓細胞更加堅硬，這樣它們就能夠承受表面張力改變所引起的任何可能的有害影響。