Figure 2 NIR和IR雙光子激發和釋放光譜。通過在同一焦平面對不同波長的Ti：Sa激光和OPO激光獲取多幅圖像并對掃描間的能量強度和漂白進行校正后的激發光譜。為獲取紅色和內在熒光團以及SHG的釋放光譜，信號通過物鏡，光譜儀和CCD相機檢測。 (a) 自然狀態下，SDS-PAGE前后的表達細胞質DsRed2 和組蛋白-2B-EGFP的HT-1080細胞.方框表明了光譜獲取的區域。(b) EGFP, DsRed2, 和 Alexa Fluor 660的雙光子激發光譜.實線代表了SDS-PAGE中分離的蛋白或Alexa Fluor 660，虛線代表了活的雙色細胞中的。計算的1100nm對DsRed2的激發效率比760nm要高20倍。(c) 活的非固定的HT-1080雙色細胞中830 nm對EGFP和1100 nm對DsRed2的同時激發。 Bars, 20 μm。
從活的雙色人纖維肉瘤細胞HT-1080獲取的EGFP和DsRed的吸收和激發光譜展示了核EGFP/組蛋白-2B（H2B）和細胞質DsRed，以及從細胞中導出通過電泳分離的分離蛋白。(Figure 2a).據報道，對EGFP最有效的激發波長為930nm，但在1060和1350nm之間沒有激發。相對的，DsRed在760nm處有一個小的激發峰，而從1090到1120nm處的激發效率是高于它20倍 (Figure 2b). Alexa Fluor 660表明在1070nm和1300nm間有一個1180nm的強激發峰(Figure 2b).
使用兩個不同波長的光束進行成像，它們的焦點必須精確地重合到一起。水平方向的通過對一個參比結構的成像如縱橫交叉的膠原纖維的SHG成像調節一束光相對另一束的傾斜來實現。為匹配軸向的焦點位置，將會用到OPO的光束整形設備中的望遠鏡(Figure 1a, ‘T’).當進行一個滑過均質染料溶液的雙光束激發的3D堆棧時，望遠鏡進行調整直到斜率重疊。 而且，非完全重疊將可能會導致來自不同樣品平面的重像。使用EGFP和DsRed2在活的雙色HT-1080細胞的同時激發，小的褶皺和核內結構被以非常好的空間分辨率檢測到(Figure 2c),確定了IR-MPM在組織活細胞中高分辨率成像的應用。
為同時激發熒光和其它特殊信號如組織結構中釋放的SHG，用于混合激發的理想波長被確定。 由于SHG是一個非對稱性過程，前向的信后是后向信號的4到8倍；因此，熒光和SHG信號的配準分別通過透鏡和聚光器在后向和前向獲取。纖維狀膠原展示了來自一個輸入波長范圍最大1100和1189nm的窄的SHG帶寬 (Figure 3a). 與NIR在纖維狀真皮膠原產生的SHG信號相比，釋放光強度比1100nm激發(V Andresen, WM Heupel, P Friedl, unpublished data)的光強5-30倍。SHG對自發熒光的比值大約為500:1(Figure 3b),這超過了Ti：Sa激發的典型比值。因此1100nm是一個適用于同步激發DsRed2，Alexa Fluor 660, 和富含膠原組織的SHG信號的合適OPO波長。
光漂白，光損傷和組織穿透
對于活細胞顯微成像，重復暴露在激光下會導致熒光團的光漂白，活性氧中間體的形成和熱，最終在成像靈敏度和細胞活性與功能間進行折中。活細胞在1100nm處對DsRed2的光漂白分別低于以880nm和760nm激發的4到10倍 (Figure 4a).在117mw的高激光能量情況下，活細胞中的EGFP和DsRed2分別在500和1700次連續掃描后發生聚集，分別對應760nm和880nm，3和10分鐘的連續照明(Figure 4b).作為對照，使用1100nm的激發波長進行104次掃描或60分鐘的連續照明時間后沒有檢測到蛋白的聚集(Figure 4b). 為排除非結構性和潛在的光損傷，由于肌動蛋白驅動的細胞遷移對能量依賴的即時性和對物理化學傷害的敏感性，檢測了這一過程。盡管樣品被暴露在1100nm的光下超過14小時(Figure 4c)，仍然沒有發生細胞遷移或激光誘導的毒性，包括細胞變圓，蛋白質凝集或熒光的損傷。因此，IR-MPM展現了非常低水平的光漂白和光損傷。
Figure 3．IR雙光子二次諧波信號(a) 自然狀態人皮膚（左）中膠原蛋白豐富區域的SHG光譜（右）。方框，測量區域。(b) 1100nm處人類皮膚的釋放光譜。方框表明了角質層，表皮和真皮中獲取光譜的區域。纖維狀膠原的SHG峰位于激發波長的一半處。
