LacZ和trpE融合蛋白的表達及純化實驗

大腸桿菌

氨芐青霉素 IAA IPTG PBS 鹽酸胍 Tris·Cl

超聲波發生器 透析袋 轉子 離心機

利用pUR載體表達lacZ融合蛋白：

1a.  按正確的讀框將目的基因亞克隆入pUR載體中，轉化大腸桿菌感受態細胞，在LB/氨芐青霉素平皿上挑選轉化子。

2a.  接種含表達載體的單菌落于2~5 ml LB/氨芐青霉素培養基中，37℃振蕩培養過夜。

3a.  取1 ml 過夜培養物加入盛于2 L 瓶中的400 ml LB/氨芐青霉素培養基中，37℃振蕩培養直至OD₆₀₀達到0.5。

4a.  加1.6 ml 100 mmol/l IPTG（終濃度為0.4 mmol/l），繼續培養2 h。

利用pATH載體表這trpE融合蛋白：

1b.  按正確的讀框將目的基因亞克隆入pATH載體中，轉比大腸桿菌感受態細胞，在添加了色氨酸的M9培養基平皿上挑選轉化子。

2b.  接種含表達栽體的單菌落2~5 ml 添加了色氨酸的M9培養基中，按步驟“2a”般培養過夜。

3b.  取1 ml 過夜培養物加入400 ml 不含色氨酸的M9培養基中，37℃下劇烈振蕩培養至OD₆₀₀=0.5。
 

4b.  加入1.6 ml 的2.5 mg/ml IAA（終濃度10 μg/ml），繼續培養2 h。

5.  將細菌培養物倒入兩個200 ml 離心瓶中，4 000 g 離心10 min。

6.  在沉淀中加入5 ml PBS，上下吹打使之重懸，將每瓶的沉淀移入一個15 ml 錐形離心管中，3 000 g 離心10 min。

7.  將細菌重懸于2 ml 含蛋白酶押制劑的HEMGN緩沖液中，加20 μl 50 mg/ml 溶菌酶，在冰浴上放置5~30 min。

8.  用微探頭超聲波發生器破碎細胞，每次15 s，共2次，在超聲處理的間隔期，樣本應置于冰浴。將裂解物倒入一個50 ml 離心管中。

9.  將細胞裂解物以27 000 g 離心15 min，倒出上清并予保留。保留沉淀，其中含有幾乎全部的不溶性的誘導蛋白。可溶性蛋白的制備按下一歩驟進行。

10.  將沉淀重懸于2 ml 含蛋白酶抑制劑的HEMGN緩沖液中。

11.  加入2 ml HEMGN緩沖液/8 mol/l 鹽酸胍（胍的終濃度為4 mol/l）4℃下溫和地振蕩30 min。

12.  在預先冷卻的超速離心機內以27 000 g 離心30 min，或4℃下27 000 g 離心20 min。

13.  將上清移入透析袋中分2步透析，每次3 h 以上甚至過夜：首先在500 ml HEMGN緩沖液/1 mol/l 鹽酸胍中透析，接著在1 L 不含胍的HEMGN緩沖液中透析。

14.  將所有材料移入離心管中12 000 g 離心5 min，保留上清，它是一種清亮、無色的液體，蛋白濃度約為1 mg/ml。（融合蛋白一般占總蛋白的1%到10%），不溶性沉淀通常也含有融合蛋白，可用于凝膠純化，應予以保留。

15.  用Bradford 法測定細胞裂解物上清及沉淀及胍提取后最終的上清及沉淀中的蛋白質濃度。經SDS-PAGE檢驗誘導結果，每孔加樣5~ 10 μg的蛋白質。