MSCs培養物的擴增和凍存實驗

MSCs

無菌完全培養培養基（CCM）、PBSA、胰蛋白酶 EDTA

聚丙烯離心管 15 mL和50 mL、塑料組織培養皿 直徑15 cm、塑料微量移液器槍頭

(a)檢査所得的MSCs。如果培養物中小的、貼壁、紡錘形的成纖維細胞樣細胞匯合至60%時，對其進行處理。如果單層細胞稀疏,繼續潤洗和更換培養基。

(b)按如下步驟消化單層細胞：用20 mL預熱的PBSA潤洗單層細胞后，加人5mL胰蛋白酶/EDTA。將培養皿置于37℃ 2min，在1O×放大倍數視野下觀察單層細胞。貼壁細胞應正從塑料培養瓶上脫落。將培養皿置于37℃ 2min,再次觀察。重復觀察直到90%的MSCs已從培養瓶中脫落下來。加人5mL CCM,將10mL懸液移至15 mL離心管中，500g離心10 min。離心完畢，棄去上清，每管用1?2mL預熱的PBSA重懸沉淀。如有必要，混合多管細胞懸液只進行一次細胞計數。

(C)取10μL細胞懸液加人到10μL臺盼藍中，用血細胞計數器進行計數。合適的細胞懸液濃度為（2?5)×10⁵個細胞/mL，存活率需高于80%。胰蛋白酶消化后用于傳代的早期培養物懸液，亦可進行集落形成單位（CFU)測定、凍存或分化測定。

(d)將細胞以50?100個細胞/cm的密度接種到培養皿中，保持低密度以保證快速的自我更新和多潛能特性。用預熱CCM以7×10³(最終密度為50個細胞/cm2)到1×10⁴(最終密度為100個細胞/cm²)的密度重懸MSCs。

(e)預備適當數量的15 cm培養皿，加人25 mL預熱的CCM。

(f）接種1 mL步驟（b)和（c)所得的細胞懸液。來回滑動平皿（勿打圈）使細胞分布均勻。培養皿置于培養箱中，標記為一代細胞。

(g)培養2?3天后，觀察并評價形態。MSCs應為小的、紡錘體形狀，頻繁折光的雙聯體。此為培養良好的MSCs。

(h)從培養皿中吸出培養基，用20 mL預熱的PBSA潤洗，加入25 mL預熱的新鮮CCM。

(i)每次傳代時所需的培養皿數量取決于可以接種的細胞數量。方案中的上述體積適用于MSCs接種至單個15 cm培養皿。如有需要可按此例擴大以接種多個培養皿。